基因克隆及克隆基因的表达讲述.ppt

大肠杆菌/酵母菌穿梭载体 ： 1. 在E.coli中复制与筛选 *pUC ori , Ampr 2. 在酵母细胞象细菌中质粒一样复制（2u origin） 3. 在酵母细胞中表达外源基因 *酵母可识别的启动子 4. 筛选标记： 营养缺陷筛选 URA3 2. 酵母质粒表达载体 二、昆虫表达系统 昆虫病毒：baculovirus 转递质粒载体 1、可对蛋白质进行翻译后加工修饰 2、可高水平表达外源基因产物 3、操作相对简单已经商品化 4、蛋白准确定位如分泌到膜外。 载体： 昆虫表达系统的组分： 昆虫细胞 优点： 原核表达系统： 外源基因引入原核细胞，使其快 速高效表达基因产物。 真核表达系统： 外源基因引入真核细胞，使外源 基因在真核细胞中表达。 表达体系 第一部分.外源基因在原核细胞中的表达 原核细胞表达系统组成 二、原核表达载体 一、原核宿主细胞 大肠杆菌（E.coli) 优点：简便, 快速、成本低 可高密度发酵培养 20-30min 12 hours 6-8 Billion bacteria Once the recombinant system is established, it is cheap to manufacture. insulin Recombinant 一、原核宿主细胞 注意： 用来克隆基因和表达基因的菌株不一样， 表达时，选用与表达载体相匹配的菌株。 ①生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。 ②基因组结构简单，便于基因操作和分析。 ③多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。 ④生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。 ⑤不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。 ⑥内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定性。 原核生物作为基因表达系统的受体细胞具有如下的特点： 二、原核表达载体 在原核细胞中表达外源基因的载体。 质粒： 噬菌体： 最方便， 最常用。 长片段 原核表达质粒 强启动子 终止子 SD序列 1、原核表达质粒的元件： ori PT7 SD MCS Terminator Prokaryotic Expression Plasmid Prokaryotic promoter Lac I start piont Ampicillin resistance 克隆元件： 表达元件： 复制原点插入位点 筛选标记 启动子 终止子 SD mRNA 多肽链 利用强启动子，增加蛋白质的生物合成 转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤， 因此，选择强的、可调控启动子是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。 原核表达载体的启动子都是可诱导的, 目的是在需要目的蛋白的时候才表达它. 最理想的可调控启动子应该是： 早期阶段：启动子被阻遏 当细胞数目达到一定密度时：通过诱导使阻遏物失活，RNA聚合酶快速起始转录。 Plac： 受Lac阻遏蛋白负调节， 受IPTG的诱导。 PL启动子：噬菌体早期 左向启动子。 常用的 原核启动子 PR启动子：噬菌体早期 右向启动子。 受λ噬菌体CI基因调控