下游技术 综合.pptx

;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程 不同密度或不同大小及形状的物质在重力作用下的沉降速率不同，在形成密度梯度的液相体系中的平衡位置不同。 离心分离过程就是以离心力加速不同物质沉降分离的过程。被分离物质之间必须存在或经人为处理产生的密度或沉降速率差异才能以离心方法进行分离。 离心分离方法中差速离心法操作最简便，使用最广泛，但其分离纯化分辨率低于密度梯度离心。;;;;;;;;;;;;;;;;一、细胞壁结构;外层：甘露聚糖（约占30%，以α-糖苷键联结（并非所有酵母菌都有）} 内层：葡聚糖（约占30-40%，由D-葡萄糖以β-糖苷键联结） 中间层：蛋白质（含6-8%，多为酶类） ;b.壁外成分： 有些菌壁外含有由多糖构成的类似荚膜的结构。 包括异多糖、甘露聚糖和淀粉类物质。 c.细胞壁的少量组分—脂类和几丁质（chitin)：为聚乙酰氨基葡萄糖 几丁质并不是所有的酵母菌中都有，其含量也因种而异。裂殖酵母一般不含几丁质，酿酒酵母含1～2%，有的假菌丝酵母含量超过了2%。 ;植物细胞壁;二、细胞破碎动力学;破碎率的评价;三、细胞破碎方法;（一）机械破碎 主要有高压匀浆法、珠磨法、撞击破碎和超声波破碎 特点：处理量大，破碎效率高，速度快。 ;方法;方法;1、高压匀浆法;2) 影响破碎率的因素;2、珠磨法;影响破碎效果的因素： 磨珠大小、搅拌速度、流量、细胞浓度、装珠量、温度等。要想获得一个最大破碎率，要有较高的装珠量、较高的搅拌速度、较小的磨珠直径和适中的细胞浓度。 珠磨的细胞破碎效率随细胞种类而异，随搅拌速度和悬浮液停留时间的增大而增大。 珠磨法适用于绝大多数微生物细胞的破碎。;对于释放胞内酶而言，细胞完全破碎是不必要的，胞内酶的释放速率取决于其在细胞中的位置； 细胞浓度对破碎过程有着非常重要的影响，一般通过响应曲面法分析优化，得到一个最佳细胞浓度和珠磨时间。;(3)喷雾撞击破碎; 声频高于15～25KHZ的超声波在高强度声能输入下，利用空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞破碎。 超声波—气泡形成—气泡长大—破碎 超声波的声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型均影响破碎效率。 缺点：产生化学自由基团—氧化产物，且噪声大。 ;4、其他类型机械破碎法;（二）化学和生物化学渗透;酶溶法 利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法进一步破坏。 酶的主要作用是破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破碎目的。 ;诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。 缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。;某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。;通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。;变性剂法 加入变性剂，可削弱氢键作用，使胞内产物相互之间的作用力减弱而易于释放。如盐酸胍。 温和化学渗透剂处理 渗透剂一般采用分子量较小的非极性甘氨酸、丙氨酸，其更易渗透到细胞壁中，通过氢键、范德华力、静电引力等化学亲和力改变细胞壁结构，从而改变细胞的通透性。同时能维持ADH的高活性，有广泛的应用前景。;（三）物理破碎法;选择细胞破碎方法的依据（重点）;选择细胞破碎方法的依据;三、胞内产物的溶解及复性;1、包含体及其形成; 包含体是蛋白的沉积与溶解的不平衡状态形成的一种动力学结构。 包含体蛋白的聚体是个可逆过程，蛋白质水平的表达、蛋白质形成错误的二硫键、重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏相应的翻译后加工功能，蛋白折叠过程中缺乏酶和辅助因子等是包含体形成的主要原因。;2、包含体的分离和溶解;包含体中重组蛋白处于错误折叠状态,主要靠非共价键连接,唯一的共价键是二硫键，因此要获得正确的折叠首先要破坏二硫键和非共价键。 方式：蛋白质解体变性，不溶的聚体成为可溶性蛋白。强变性剂破坏次级键，引起构象解体。去污剂与蛋白质疏水区作用，避免蛋白形成疏水核心。还原剂有助于半胱氨酸维持还原态，可防止碱性条件下形成二硫键而聚集。螯合剂可防止金属催化的半胱氨酸空气氧化。 ;3、蛋白质复性;（一）蛋白质复性方法（重点）;（2）透析复性： 将变性蛋白质装入透析袋中，对复性缓冲液进行透析。也是基于去除变性剂的机理使蛋白质复性。 特点：透析过程主要是扩散作用，需时间较长，易造成蛋白