第13章沉淀法提取抗生素概述.ppt

有机溶剂沉析的特点 分辨率高； 溶剂容易分离，并可回收使用； 产品洁净； 容易使蛋白质等生物大分子失活； 应注意在低温下操作； 成本高 * 运用有机溶剂沉淀蛋白质应注意的因素： 温度； 有机溶剂的浓度； pH值； 蛋白质浓度。 * 20世纪60年代非离子型聚合物开始用于分离血纤维蛋白原和免疫球蛋白，从此高相对分子质量非离子聚合物沉淀蛋白质的方法被广泛使用，如：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖等。 4. 非离子型聚合物沉淀法 * 基于体积不相容性，即PEG分子从溶剂中空间排斥蛋白质，优先水合作用的程度取决于所用PEG的分子大小和浓度，排斥体积与PEG分子大小的平方根有关。 PEG沉淀作用的机理 * 体系的温度只需控制在室温条件下； 沉淀的颗粒较大，产物易收集；PEG非但不会使大多数蛋白质变性，且可提高其稳定性。 优点 缺点 PEG难从蛋白质溶液中除去。 * 聚电解质是含有重复离子化基团的水溶性聚合物，可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖如肝素等。 蛋白质分子的相反电荷与聚电解质结合，形成一个多分子络合物，当络合物超过游离蛋白质的溶解度极限值时，就发生沉淀。 沉淀机理 * 5. 聚电解质沉淀法 能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的金属离子，如：Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cd2+； 6. 金属沉淀法 沉淀机理 金属离子能与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。 金属离子沉淀蛋白质可分为三类： * 能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的金属离子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+； 与巯基化合物强烈结合的金属离子，如：Hg2+、Ag+、Pb2+。 实际使用时，金属离子的浓度常为0.02 mol/L。 * 近来，对于金属离子沉淀蛋白质的概念有所扩大，开始使用金属的螯合物来进行沉淀，如：用锌的螯合物与基因工程的聚组胺酸肽段相结合，从而使蛋白质沉淀。 * 6. 其它沉淀方法——（1）亲和沉淀 亲和沉淀是利用蛋白质与特定的生物的或合成的分子(免疫配位体、基质、辅酶等)之间高度专一性的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。该方法提供了一个从复杂混合物中分离提取出单一产品的有效方法。 其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。 * 初始阶段：将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲和配体络合成沉淀； 所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质； 用一种适当的试剂将目标蛋白质从配体中离解出来。 该技术的三个步骤： * 蛋白质 配体 载体 胰蛋白酶 对-氨基苯脒 苯甲基聚丙烯酰胺 小麦胚芽凝集素 N-乙酰半乳糖胺亚单位 壳聚糖 乳酸脱氢酶 汽巴克弄蓝 葡聚糖 表2 亲和沉淀纯化蛋白质的实例 * （2）选择性变性沉淀法 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方法就称为选择性变性沉淀法。 * （1）例如对于α-淀粉酶等热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。 （2）根据欲分离物质所含杂质的特性，通过改变pH值或加进某些金属离子等使杂蛋白变性沉淀而被除去。 * （3）选择性溶剂沉淀法 核酸的沉淀分离，可以选择适宜的溶剂进行处理，使蛋白质等杂质变性沉淀而获得核酸，这种方法又称为选择性溶剂沉淀法。 * （1）在核酸提取液中加入氯仿-戊醇或氯仿-辛醇，振荡一段时间、使蛋白质在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。 （2）在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在的条件下，用苯酚-水溶液提取核酸，DNA、RNA存在于水溶液中，而蛋白质在苯酚层中形成沉淀而被除去； （3）在DNA、RNA混合溶液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA，而RNA留在溶液中。 * 说明 选择沉淀方法时，应从以下几方面综合考虑： 沉淀剂是否会引起蛋白质分子破坏； 沉淀剂本身的性质； 沉淀操作的成本、难易程度； 残留沉淀剂的去除难度，最终产品的产率及纯度的要求等。 * 五、沉淀法应用 利用蛋白质沉淀大规模提纯蛋白与免疫球蛋白的工艺 柠檬酸的生产 萃取-沉淀法提取分离茶多酚 * 标准沉淀法回收柠檬酸流程图 加热到70℃ * 思考: 1、蛋白质的溶解特性如何？ 2、中性盐盐析法的机理是