2第二章3核酸化学研究.ppt

第四节 RNA的结构与功能 一、结构特点 碱基组成 A、G、C、U （A＝U/G≡C） 稀有碱基较多，稳定性较差，易水解 多为单链结构，少数局部形成螺旋 分子较小 分类 tRNA （转运） mRNA（信使） rRNA （核糖体）核酶　 hnRNA （核不均一RNA） 内含子 snRNA （小） asRNA （反义） 少数RNA病毒 二、tRNA（活化氨基酸的搬运工具） 占RNA总量的10-25％，主要存在于细胞液中 每一种氨基酸对应最少一种RNA，一般可有1-6个tRNA搬运 70多种 分子量25000左右，大约由70－90个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。 结构特点 3-末端都具有CpCpAOH结构。 分子中含有较多的修饰成分。即稀有碱基多 二级结构：三叶草型 三级结构：倒L型 tRNA的二、三级结构 三、rRNA（蛋白质合成的（空间）内能） 占RNA总量的80％ 4种与70多种蛋白质构成核糖体 40%蛋白质，60% rRNA 四、mRNA（蛋白质合成的模板） 占细胞总RNA的3％～5％ 代谢快，寿命短 碱基的排列顺序决定蛋白质肽链上氨基酸的排列顺序 真核细胞mRNA的3‘-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为 “尾结构” ，5’ -末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为” 帽结构“ 。 五、其他RNA hnRNA （核不均一RNA）： mRNA的前体 snRNA （small nucleic RNA 核小RNA） asRNA （antisense RNA）：通过互补序列与特定的mRNA结合，抑制翻译。还可以抑制DNA的复制和转录。 应用于延长水果的保存期。 第五节 核酸的性质 一、一般的理化性质 两性解离 / 一般呈酸性（在中性溶液中带负电荷），微 溶于水，不溶于有机溶剂 线性大分子（粘度高。抗剪切力差） 可用电泳或离子交换（色谱）进行分离 室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解 D－核糖＋浓盐酸＋苔黑酚 鲜绿色-墨绿-黑 D－2－脱氧核糖＋酸＋二苯胺 蓝紫色 二、核酸的紫外吸收特性 在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。 以A260/A280进行定性、定量 DNA和RNA溶液中加入溴化乙锭（EB），在紫外下发出荧光 三、核酸的变性、复性与分子杂交 1. 变性 稳定核酸双螺旋次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。核酸的的一级结构(碱基顺序)保持不变。 变性表征 生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应） 变性因素 pH(11.3或5.0） 变性剂（脲、甲酰胺、甲醛） 低离子强度 加热 2. 热变性和Tm DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。 一般DNA的Tm值在70-85?C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。 G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 3. 核酸的复性 变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性。 DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有减色效应。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性的DNA缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。 退火温度＝Tm－25℃ 复性影响因素 片段浓度：正相关 片段大小：负相关 片段复杂性（重复序列数目）正相关 溶液离子强度 4.分子杂交 DNA单链与在某些区域有互补序列的异源DNA单链或RNA链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。 广泛应用于测定基因拷贝数、基因定位、确定生物的遗传进化关系等。 Southern 杂交（Southern bolting） Northern 杂交（Northern bolting） 四、核酸的序列测定 双脱氧链终止法（Sanger酶法） Gilbert化学降解法 本 章 小 结 核酸是遗传物质载体的证明和研究历史 核酸的化学结构：戊糖、碱基（A、T、G、C、U），核苷、核苷酸及其衍生物的结构特点（原子编号） DNA的结构：一级结构（核酸序列及其表示、基因及基因组、序列测定）、二级结构（ Watson －Crick双螺旋模型、 A