第九章放射性核酸探针的制备及应用概述.ppt

第九章 放射性核酸探针的制备及应用 探针（probe）是指经放射性等物质标记的特定的DNA或RNA序列。 利用探针通过核酸杂交可检测特定的基因或转录产物。 在基因克隆、鉴定和分析的许多方面都涉及到利用探针进行杂交，例如，鉴定cDNA和基因组DNA文库，需要用标记探针与菌落或噬菌斑杂交；分析目的基因的转录和加工情况需要用标记探针与RNA杂交，定位特定目的基因的位置，需要Southern杂交；构建限制酶图谱也可利用杂交。总之，核酸杂交的使用范围很广。 因杂交是在目的DNA与放射标记探针之间进行，故在进行利用杂交的分子克隆工作中经常需要制备各种核酸探针。 核酸探针根据核酸的性质可分为DNA和RNA探针； 根据用放射性标记物标记与否，可分放射性核酸探针和非放射性核酸探针； 根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针； 根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。 一、双链DNA探针 1、切口平移法(Nick translation) 2、随机引物合成法 二、单链DNA探针 1、从M13载体衍生序列合成DNA探针 2、从RNA合成单链cDNA探针 三、末端标记DNA探针 1、3，末端标记 2、5，末端标记 (1) 前向反应(Forward reaction) (2) 交换反应(Exchange reaction) 四、寡按苷酸探针 1、 T4多核苷酸激酶标记 2 、末端转移酶标记(Altar等，1989) 3、 Klenow片段标记 五、RNA探针 第二节 放射性核酸探针在分子生物学研究中的应用 放射性核素（32P、3H、35S或125I）标记的核酸探针，已成为分子生物学研究的重要工具。 它的利用，使得人们能够从分子水平上直接进行遗传物质的检测（即基因的定位、定量和顺序分析）以及重组DNA中目的片段的鉴定。这已成为同位素示踪技术的一项新的内容。 放射性核素探针与分子杂交技术相结合，可以用来鉴别重组子、分离基因、分析DNA片段、研究基因表达。 本节主要介绍放射性核酸探针在分子生物学研究中的应用，同时介绍有关分子杂交的部分内容。 一、分子杂交的基本原理 互补的核苷酸序列通过Watson-Crick碱基配对而形成稳定的双链分子的过程称为杂交。 形成杂交分子的前提是核酸单链之间具有一定的互补序列（即有某种同源性）。 分子杂交是通过印迹将核酸分子固定在固体支持物上，然后用放射性标记或非放射性标记的探针与被固定的分子杂交，经显影显示出目的DNA或RNA分子所处位置。 二、Southern杂交 三、放射性核酸探针在分子生物学研究中的应用 （1）筛选载体 外源DNA需要与某种工具重组，然后才能导入宿主细胞中进行克隆和保存或表达外源DNA中的遗传信息，这种将外源DNA携带进入宿主细胞的工具称为载体。根据核酸序列的同源性，利用放射性核酸探针与转化后宿主细胞中的质粒或噬菌体进行杂交，可以筛选出重组的质粒或噬菌体。从而实现重组载体的筛选。 （2）检测基因表达 细胞核内的DNA片段通过转录形成mRNA并释放到细胞质中。被检测基因在细胞中的转录情况可以进行如下分析： ① Northern杂交 检查细胞中是否含有特定的mRNA，测定特定mRNA在总RNA中的比例，由此获得目的mRNA的转录情况。 ② 斑点杂交 应特异性探针检测mRNA，并估计表达过程中mRNA的转录程度。 （3）筛选基因文库 由于在构建文库的工作中需要筛选大量的重组子，通常都采用杂交进行筛选，以便在较短的时间内获得阳性克隆。用DNA片段作为探针进行杂交的溶液主要有：甲酰胺；水溶液。这两种溶液都能得到良好的结果。 （4）鉴定作物品种 由于不同品种的作物，其DNA和mRNA存在着差异，因此用特定的核酸探针进行不同品种间的分子杂交，可得到不同品种在遗传物质上的差异。 （5）诊断与鉴定病害 在病害的诊断和鉴定中，核酸探针技术被认为是一种非常有力的手段。它不仅能确定染色体组的组成和基因的功能，而且为病毒的诊断和确定病毒间的关系提供了新途径。 （6）加快DNA序列分析 对大片段的DNA进行序列分析时，可用限制酶将它酶切成小片段，再用已知序列的核酸探针进行杂交，测定它们间的同源性。这样可以大大加快序列的测定过程。 * 第一节 放射性核酸探针的基本类型与制备方法 Middle Southern blotting：1975年，E. M. Southern利用毛细作用将DNA转移到硝酸纤维纸上，……. Northern blotting：1977年，Alwine利用毛细作用将RNA转移到硝酸纤维纸上，……. Western blotting：1979年，Towbin利用电场作用进行蛋白质转移，…….