重组葡萄球菌肠毒素对猪先天免疫功能影响.pdf

摘 要 SEs 葡萄球菌肠毒素（ ）作为超抗原能促进淋巴细胞增殖，引起机体广泛的 炎症反应。肠毒素作用迅速、产生炎症能力强，暗示其可能影响先天免疫应答机 制介导适应性免疫，促进炎症的产生。Toll样受体 （TLRs)作为先天免疫模式识 别受体，在先天性早期抗感染、炎症反应及调节适应性免疫中有重要作用，但 TLRs对葡萄球菌肠毒素刺激的应答反应尚不清楚。本文研究了重组葡萄球菌肠 毒素对猪先天性免疫分子TLR转录表达、其介导的炎症因子表达的影响，以探 讨肠毒素引发先天免疫应答的分子机制，主要研究结果如下： 应用RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中克隆了8种Toll样受体（TLR1、2、 4、5、6、8、9、10）全基因，利用生物信息学技术分析其单核苷酸多态性（SNPs） 和氨基酸功能区，预测TLR蛋白高级结构及其配体识别域，从结构角度分析突 变氨基酸对TLR功能的影响。结果发现TLR基因序列具有个体差异性和种属特 异性，其非同义突变主要位于胞外区，推测其病原识别具有多样性。预测的8种 TLR分子均为 型跨膜蛋白，胞外区富含亮氨酸重复序列（I LRRs）；二级结构 主要由α-螺旋、β-折叠组成；TLR单体和二聚体分别为马蹄形和“M”形。 设计TLR1-10及先天免疫应答相关分子IL-1β、MCP-1、MIP-1β、GM-CSF、 TNF-α IFN-γ IL-2 IL-4 、 、 、 的特异性引物，建立了检测上述分子转录变化的相对 荧光定量PCR方法 （qRT-PCR），从特异性、敏感性、重复性等方面优化了PCR 条件。结果显示退火温度为50℃时，cDNA浓度在初始浓度或2倍稀释时，各因 Ct 子 值处于最适范围且荧光强度高，溶解度曲线无杂峰，产物电泳条带单一， 各基因组间和组内重复性实验变异系数均保持在3.5%以内。 运用相对荧光定量PCR 和ELISA 分别检测了肠毒素对猪先天免疫分子 TLR1-10、多种细胞因子体内外转录、表达的影响。MTT实验表明葡萄球菌肠毒 素可促进猪淋巴细胞增殖，肠毒素可导致体外培养的肺泡巨噬细胞TLR1、2、6、 10mRNA转录显著增加，通过活化TLR途径产生大量促炎因子，如IL-1β、TNF-α、 GM-CSF MCP-1 MIP-1β IL-2 IL-4 克隆刺激因子（ ）、趋化因子（ ）及炎性因子 、 、 、 IFN-γ等；体内检测的外周血淋巴细胞（PBMC）转录TLR1-10、MCP-1、IL-2、 IL-4、IFN-γ等的能力增强，形成细胞因子风暴。通过注射不同肠毒素的肠结扎 5 SEU 实验表明， 种肠毒素 （ 除外）均能引起猪小肠不同程度的水肿，炎性细胞 增多，细胞间隙增大；不同肠毒素处理肠段TLR6转录均上调，但不同肠毒素对 同型TLR及细胞因子转录的影响不同，同种肠毒素对不同TLRs及细胞因子转 录影响也不同。 万方数据 TLR1 2 6 10 以上研究表明，葡萄球菌肠毒素可活化先天免疫分子 、 、 、 及其 信号转导途径，刺激炎性因子产生，TLR6可能为肠毒素的识别受体；SEs可通 过刺激淋巴细胞增殖、或通过巨噬细胞免疫反应途径导致细胞因子风暴，引起猪 多系统炎症或肠道局部炎症。 关键词：葡萄球菌肠毒素 先天免疫 Toll样受体