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比较蛋白质组学及系统研究方法 比较蛋白质组学及系统研究方法 蛋白质的合成受时空等多种因素调控，在不同的组织细胞中蛋白质合成及表达的种类和数量有很大的差异，即使在细胞发育的不同阶段，因不同时期、不同条件，蛋白质组的构成也在不断的变化，是动态的过程 第一部分：基本概念 比较蛋白质组学及系统研究方法 第一部分：基本概念 蛋白质组(Proteome) 指由一个基因组，或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。 比较蛋白质组学：蛋白质组间差异蛋白的研究。 比较蛋白质组学及系统研究方法 第一部分：基本概念 比较蛋白质组学基本技术路线 Introduction 第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法 比较蛋白质组学及系统研究方法 Introduction 比较蛋白质组学及系统研究方法 第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法 应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。 样品的分级处理 可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。 样品制备对于获得可靠、准确的2D电泳结果至关重要 Introduction 比较蛋白质组学及系统研究方法 第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法 增加样品溶解性的手段 变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。 表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。。 还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。 比较蛋白质组学及系统研究方法 第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法 —水浴加热处理 —Triton X-114相分离法提取膜蛋白 —蛋白质沉淀及透析除杂 —真空冷冻干燥 硫转运膜蛋白质的有效分离和提取 双向电泳分离膜蛋白 比较蛋白质组学及系统研究方法 第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法 双向电泳具体步骤 蛋白预处理（裂解，水化） 蛋白质上样缓冲液的配制：一定量的 蛋白质样品溶解在 缓冲液含 7 mol/L 尿素， 2 mol/L 硫脲，4% CHAPS，1% NP-40，2% IPG 缓冲液，65 mmol/L DTT ，0.002%溴酚蓝 IPG条重泡涨及上样 第一向：IEF IPG条平衡 平衡缓冲液Ⅰ(还原) 平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化) 第二向：SDS 胶条染色及脱色 凝胶成像及图像分析 比较蛋白质组学及系统研究方法 第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法 凝胶的图像处理分析和差异蛋白质点的挖取及胶内酶切 凝胶图像的扫描 图像加工 斑点检测和定量 凝胶配比 数据分析 数据呈递和解释 2-DE数据库的建立 差异蛋白质点的挖取 胶内酶切 Image Master 2d Platinum 图像分析软件可 用于胶的图像分析 比较蛋白质组学及系统研究方法 第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法 Introduction 比较蛋白质组学及系统研究方法 第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法 差异蛋白质点的挖取及脱色、胶内酶切 元素硫基质中膜蛋白2-DE图谱 亚铁基质中膜蛋白2-DE图谱 选取差异表达的蛋白质点，经过脱色处理后用胰蛋白酶（Trypsin）进行特异性酶切，最后进行质谱分析得到相关肽指纹图谱 比较蛋白质组学及系统研究方法 目前双向电泳需解决的问题 样品的制备及溶解 膜蛋白疏水性强 初步分离 高丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白 灵敏度及可重复性 第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法 N-端测序： 得到的是序列。未知蛋白测序。称为Protein Sequencing 。 生物质谱分析 ：返回的数据是分子量。可以和已知的蛋白（数据库）比对，告诉你是什么蛋白。称为Protein Identification by MS。 比较蛋白质组学主流手段是生物质谱分析 ，价格便宜，分析速度快。 比较蛋白质组学及系统研究方法 第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法 比较蛋白质组学及系统研究方法 第二部分：比较蛋白质组学系统研究方法 质谱分析原理 进样系统 1.气体扩散 2.直接进样 3.色谱 离子源 1.电子轰击 2.化学电离 3.场致电离 4.激光 质量分析器 1.单聚焦 2.双聚焦 3.飞行时间 4.四极杆 检测器 MALDI-TOF 一级质谱仪，二级质谱，MALDI-TOF-TOF 串联质谱仪，LC-MS/MS