第7章蛋白质分离纯化与表征资料.pptVIP

蛋白质分离纯化是利用其特性的差异 分子的大小和形状 酸碱性质 溶解度 吸附性质 对配体分子的特异生物学亲和力 蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大 pI通常在 6.0 左右 蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12 ≈1.66×10-27千克 测定蛋白质相对分子质量的原理和方法 （一） 根据化学组成测定最低相对分子质量 （二） 沉降分析法测定相对分子质量 （三） 凝胶过滤法测定相对分子质量 （四） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 （一）根据化学组成测定最小分子量 （三）凝胶过滤法测定相对分子质量 葡聚糖凝胶过滤法 （四）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 （最常用） SDS（十二烷基硫酸钠）一种阴离子去污剂，作为变性剂破坏分子内的疏水作用和氢键。 目前测定亚基分子量的最好办法。 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 （二）蛋白质的沉淀 Pr从胶体溶液中析出 任何破坏稳定蛋白质溶液的因素都可能使蛋白质沉淀 I 可逆沉淀 温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷 Pr结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解 ——非变性沉淀 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。 不可逆沉淀 强烈沉淀条件 破坏Pr胶体溶液稳定性 也破坏Pr结构和性质 沉淀不能再重新溶解 ——变性沉淀 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等 盐溶 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶 原因？ 五、蛋白质的分离纯化方法 （一）根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤 2、密度梯度（区带）离心 （二）利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 2.盐溶和盐析 （三)根据电荷不同的分离方法 1.电泳 原理： 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 分子大小不同，电场中移动速度也不同 （四）利用蛋白质选择性吸附的性质 羟磷石灰层析 疏水作用层析 （五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法 六、蛋白质含量测定和纯度鉴定 四、蛋白质分离纯化的一般原则 总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶是最后步骤 利用蛋白质分子不能透过半透膜将其 与小分子物质分开 半透膜为玻璃纸或纤维素材料 血液透析 小分子溶出 小分子被带出 透析机 透析液 加压 血液 用一定的介质（如蔗糖）在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将蛋白质混合液置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使蛋白质分层、分离。 3、凝胶过滤 3. 凝胶过滤 3.有机溶剂分级分离法 降低介电常数 争夺水化膜 影响溶解度的外部因素有：pH值、离子强度、介电常数和温度。 4. 温度对蛋白质溶剂度的影响 平板电泳 等电聚焦电泳 双向电泳 离子交换层析 亲和色谱颗粒 具有极强的专一性 （六）高效液相层析和快速蛋白质液相层析 多种类型的柱层析都可用HPLC来代替，例如分配层析，离子交换层析，吸附层析以及凝胶过滤。 * 第7章 蛋白质的分离纯化和表征 一种蛋白质的混合物在pH6的DEAE-纤维素柱中被分离，用pH6稀盐缓冲液可以洗脱C，用pH6的高盐缓冲液，B和A依次被洗脱，用凝胶过滤测定得A的Mr 是240000，B的Mr是120000，C的Mr是60000。但SDS只发现一条带。请分析实验结果 DEAE-纤维素柱层析的结果说明，在pH6的条件下，A带有较多的负电荷，B次之，C带负电荷最少。凝胶过滤法测出A的Mr是C的4倍，B的Mr是C的2倍，但SDS只发现一条带。由于SDS测定的亚基的Mr，凝胶过滤法可以测定寡聚体的Mr，可以推断C是单体，B是以C为亚基的二聚体，A是以C 为亚基的4聚体，由于C在pH6时带负电荷，随着亚基数的增加，带负电荷的量也会增加，这与DEAE-纤维素层析的结果也是一致的。 蛋白质纯化应根据研究工作和生产的具体目的和要求，制订分离纯化的合理程序。 一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质分子的大小与形状 1、测定蛋白质中某一微量元素的含量 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子 最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量 例如肌红蛋白含铁量为0.335%，那么其最低相对分子质量就是 55.8/0.335 × 100 = 16700 （二）沉降分析法 蛋白质分子在