第九章聚焦层析介绍.pptVIP

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一、流动相和固定相 流动相为多缓冲剂:由一系列精选的物质构成,在一定的pH范围具有相似的较强的缓冲能力。 Polybuffer 96和Polybuffer 74,如果将它们混合则在4~9范围都有较强缓冲能力。 固定相为多缓冲交换剂:Pharmacia 公司出售的多缓冲交换剂PBE 94和PEB 118是以Sepharose 6B为基质,通过化学方法把带有多种电荷基团的配体与其偶联而成。由于这种多缓冲交换剂存在多种类型电荷基团,所以它的缓冲能力也相当强,可以自发的形成pH梯度,同时也是离子交换的活性集团。 蛋白质的行为 蛋白质所带电荷取决于它的等电点(pI)和层析柱中的pH值。当柱中的pH低于蛋白质的pI时,蛋白质带正电荷,且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动,固定相中的pH值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境pH高于其pI时,蛋白质由带正电行变为带负电荷,并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过,蛋白质周围的环境pH 再次低于pI时,它又带正电荷,并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移,上述过程将反复进行,于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来,从而达到了分离的目的。 pH梯度下移的速度是polybuffer流速的1/10,流出时是它的等电点。 不同蛋白质具有不同的等电点,它们在被离子交换剂结合以前,移动之距离是不同的,洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。 聚焦效应 第二节 实验操作 多缓冲剂和多缓冲交换剂通常能够提供3个pH单位的跨度,如果目的蛋白的pI已知,多缓冲交换剂范围选定需包含pI。 使得样品在1/3~1/2的梯度以后才被洗脱,也就是说有1/2~2/3柱长的吸附、解吸附的差异性,提高分离效率。 如果pI未知,可以通过等电聚焦实验,或采用其它方法测得。 可以采用PBE 74+96,也可以采用PBE 94。这种多缓冲交换剂覆盖了pH9~4的范围,可以用于分离85%以上的蛋白。 流速的影响 * * 第九章 聚焦层析 chromatofucusing 聚焦层析是依据蛋白质的等电点差异和离子交换行为不同,在等电聚焦的基础上发展起来的,这一方法既有聚焦作用,同时又有高分辨率的优点。 利用离子交换技术载样量高的特点,它可以把样品集中在0.04~0.05个pH梯度内,一次层析可以纯化几百毫克蛋白。 第一节 基本原理 二、聚焦层析原理: pH梯度溶液的形成 蛋白质的行为 聚焦效应 在离子交换层析中,pH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。 pH梯度溶液的形成 离子交换层析 而在聚焦层析中,当洗脱液流进多缓冲交换剂时,由于交换剂上带有具有缓冲能力的电荷基团,故pH梯度溶液可以自动形成。 聚焦层析 9 8 7 6 pH值是沿着柱长增加的,在此pH梯度中,蛋白质的pIpH时其带负电荷与离子交换剂结合;pIpH时,其带正电荷,从离子交换剂上解吸出来, pI=pH时不移动。 6 7 pH 8 9 Protein 2 移动速率 Protein 1 蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件。 4 5 6 7 pH 在聚焦层析过程中,一种样品分次加入时,只要先加入者尚未洗出,并且有一定的聚焦时间,就还可以将样品再加到柱上,其聚焦过程仍能够顺利完成,得到满意的结果。 聚焦效果 分离效果 1、多缓冲剂和多缓冲交换剂的选择 2、柱子选择、装填与平衡 3、样品的准备 样品需溶解在洗脱缓冲溶液中(pH) 样品的体积:通常不大于0.5个柱床体积 样品组成通常不包含较大浓度的盐 4、样品的洗脱 梯度的上限由起始缓冲溶液的pH决定(通常比选定的pH大0.4) 下限由洗脱缓冲溶液决定(Polybuffer 提供的pH梯度不大于3) 梯度体积:洗脱液的缓冲能力 pH pH 流速:15cm/h 流速:117cm/h 填料非常耐压,所以可以适应高流速,从上图可见,流速增加回降低分离度,但是,这样的分离效果仍然很好。实验室通常采用30~40cm/h。 5、从样品洗脱液中去除polybuffer 沉淀法 胶过滤层析 疏水层析 亲和层析 6、再生和储存 可以在柱上进行再生。 Polybuffer的商品是无菌的,使用过程中要注意不要引入微生物。冷藏避光保存。 PBE保存于24%乙醇溶液中。 应用举例 PBE 94分离鸡卵清蛋白

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