低温产甲烷菌分离鉴定及发酵产气初步-石河子大学硕士论文答辩介绍.ppt

研究背景 化石能源是不可再生能源，终有一天会枯竭；未来生物质能等新能源的发展将举足轻重。 沼气是一种可再生能源，对于自然条件差，生态环境脆弱的新疆农村牧区，减缓传统用能方式产生的植被破坏将具有重要意义。 新疆位于我国西北严寒地区，冬季气温、地温低，达不到最佳厌氧发酵温度；研究表明沼气产量下降，是由于中温厌氧发酵菌群进入冬季后，受低温影响活力下降和大量菌株衰亡。 因此，沼气能源在新疆的推广，受制于低温厌氧发酵。产甲烷菌为厌氧发酵菌群代谢途径中关键，低温下产甲烷菌活力下降使得整个代谢途径都会受到抑制。 本课题选择筛选耐低温产甲烷菌做为解决低温厌氧发酵途径 研究内容 产甲烷菌富集培养筛选纯化 耐低温产甲烷菌株筛选 菌株形态学观察 SZ-2菌株生物学特性 菌株可用碳源底物、抗生素敏感性 SZ-2菌株可利用碳源底物 ：H2/CO2混合物、甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺作为单一碳源底物产生甲烷；不能在以甲酸盐、乙酸盐、丙醇、丁醇作为唯一碳源的培养基上生长代谢产生甲烷 。 小结 厌氧分离获得两株产甲烷菌SZ-1、SZ-2 经过筛选，SZ-2菌株符合兼性耐低温且常温也能良好产气要求 SZ-2呈八叠球状 ，15～30 ℃产气良好，TOPT=25 ℃ ；最适pH值6；最适氯化钠浓度0.2 mol/L；H2/CO2、甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺为其可利用单一碳源底物 。 SZ-2菌株不能耐受链霉素和卡那霉素 低温产甲烷菌的保藏 SZ-2菌株DNA提取、16S rDNA 扩增 克隆 酶切和质粒PCR验证 菌株测序结果及系统发育分析 小结 菌株SZ-2同源比对和系统发育分析属于产甲烷八叠球菌属菌株（Methanosarcina），并与巴氏甲烷八碟球菌属菌株亲缘关系较近 结合菌株的生理生化和形态学特征分析，菌株SZ-2与巴氏甲烷八叠球菌基本相符，只有最适温度有差异 可能是长期生长在寒冷低温沼气池中适应低温环境驯化的结果 1-2 d，甲烷产量少，共生菌受到刺激生长繁殖 3-5 d，互营共生发酵开始启动 6 d ，SZ-2开始成为优势菌株 6-11 d ，SZ-2菌株复合菌群大量繁殖 结论：6-11 d，经驯化后SZ-2菌株发酵污泥菌群具备良好耐低温发酵高效产气的能力；接种于低温沼气发酵瓶中将有利于改善沼气发酵。 厌氧发酵对比实验 一组：牛粪和秸秆混合物未添加外来菌剂进行厌氧发酵，原始菌群不能适应低温15℃环境 二组：SZ-2菌株扩大后发酵牛粪和秸秆混合物，SZ-2菌株需要对发酵环境适应、互营共生关系的建立等，发酵启动时间等受影响 三组：驯化后 SZ-2菌株复合污泥菌群，菌群互营共生关系良好；对低温发酵环境适应能力强；因此从发酵启动时间和产量上都优于前两组。 小结 耐低温SZ-2菌株能够适应低温发酵环境并与菌群建立共生关系，低温发酵的启动时间和发酵产气量增长明显 驯化后的含有SZ-2菌株的菌群能更好适应低温发酵，发酵启动时间和产气量提高效果更好。 结论 (1)厌氧条件下从沼气池和湖底采集污泥中分离两株产甲烷菌菌株，SZ-1、SZ-2；SZ-2菌株符合兼性耐低温且常温也能良好产气要求； SZ-2菌株呈明显八叠球状 ，15～30℃产气良好，25℃为最适温度，最适pH值为6，氯化钠耐受范围为0～0.4 mol/L,0.2 mol/L时最适宜；可利H2/CO2、甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺作为单一碳源底物；不能耐受链霉素和卡那霉素 。 (2)对菌株进行短期保藏时，温度控制在低温零度且添加足够营养厌氧保存最长时间2个月后菌种复活仍有活力。SZ-2菌株长期保藏，采用改进厌氧甘油低温冷冻保藏法，SZ-2菌株保藏6～8月时就应进行传代。 (3) SZ-2菌株测序；经过同源比对和系统发育分析确定属于产甲烷八叠球菌属菌株（Methanosarcina），并与巴氏甲烷八碟球菌属菌株亲缘关系较近。结合菌株形态学、结构特征、生理生化特性，SZ-2菌株为一株耐低温驯化后的兼性嗜冷巴氏甲烷八叠球菌。 (4) SZ-2菌株扩大培养后投入到模拟发酵瓶装置中，低温15℃厌氧发酵秸秆和牛粪混合物；耐低温SZ-2菌株能够适应低温发酵环境并与菌群建立共生关系，低温发酵的启动时间和发酵产气量增长明显；驯化后的含有SZ-2菌株的污泥菌群能更好适应低温厌氧发酵环境，发酵启动时间和产气量改善效果更好。 工作不足及展望 (1)筛选获得耐低温产甲烷菌种资源还不足，自然界其它环境中还存在很多优质耐低温产甲烷菌，可通过已经掌握的厌氧分离技术筛选获得更多。 (2)厌氧菌种保藏方法还需要进行改进，一种好的厌氧微生物菌种保藏方法应能够延长菌种保藏时间，提高菌种复活成活率。以后工作可通过对已有方法改进或借鉴其他技术提高厌氧条件下产甲烷菌菌株保藏时间。 (3)对于菌株发酵产气研究不能停留