基因组序列诠释课题.pptVIP

3.确定DNA序列中基因的位置 A 通过对全长cDNA序列的测序、对比，以及与基因组DNA的比较，确定基因所在的区域； B 通过物种已建立遗传图和物理图来确定基因的位置； 4.实验确认基因功能 4.1 基因剔除(knock-out) 最简便的基因失活的方法. 主要原理: 在一段无关DNA 片段的两侧连接与代换基因两侧相同的序列,将这一构建导入目的细胞,由于同源片段之间的重组,可使无关片段取代靶基因,整合到染色体中.为了便于筛选,用于取代的外源DNA中含有报告基因. 4.2 基因超表达 通过增加基因的拷贝数和采用强启动子促使基因超表达,致使受体表现出生长与发育的异常,来研究基因的功能. 4.3反义RNA 反义RNA是由基因的负链编码,可与正义RNA (sense RNA)或DNA 编码顺序结合,干扰mRNA 的转录,加工和转运,调控基因的表达. 构建反义RNA 表达载体: 将全目的基因或部分目的基因反向插入表达载体 → 转化目标生物 →获得转基因个体或品系 → 分析转基因植株在生理、生化、形态等方面的变异 → 判别目的基因的功能 正义表达载体 反义表达载体 反义RNA 作用机理： A 干扰翻译的起始与延伸，可与翻译起始顺序及编码序列结合形成双链RNA，随之被细胞降解。 B 与mRNA 的引导顺序结合，阻止核糖体的附着，使翻译无法启动。 C 反义RNA与mRNA形成双链分子后，使RNA多聚酶脱离模板,转录终止。 4.4 RNAi干涉 RNAi干涉是通过双链RNA的介导,特异性地降解相应序列的mRNA,从而阻断相应基因表达的转录后水平的基因沉默机制. RNAi 作用机理 A dsRNA核酸内切酶Dicer被激活,它把dsRNA加工成21~25 个核苷酸长的RNA链; B 这些小片段RNA(siRNA)作为另一个核糖核酸复合体RISC(RNA-induce silencing complex,RNA诱导沉默复合体)的指引物,结合到RISC上,使之识别并降解mRNA,从而导致与双链RNA同源的基因沉默; RNAi设计方法及应用 A Fraser 合成与开放读码框相对应的双链RNA或利用细菌克隆表达这些双链RNA→微量注射和喂食→干扰同源基因的表达 B Chuang 等设计出嵌合体结构 → 连接强启动子大量表达双链mRNA→干扰同源基因的表达 HbF基因的RNAi载体构建 RNAi技术的优缺点 RNAi最根本的特点是特异性 RNAi具有特殊的穿越能力,如将双链RNA注射在线虫性腺里,它也会干扰到体细胞里的基因表达,而且干扰作用会传给后代; RNAi对一些低水平表达的基因的RNAi现象并不明显,而且几个有相同或相似序列的基因, RNAi也会同时作用与它们. 4.5 酵母双杂交（yeast two-hybridization） 原理： 其原理涉及转录因子与启动子之间的互作。 正常条件下： 转录因子 （包括两个功能区域）→ 结合功能域同基因上游的区段结合 → 激活功能域激活RNA多聚酶 → 将基因转录为mRNA 酵母杂交系统中： 融合表达载体1 融合表达载体2 DNA结合功能域 +目的片段 激活功能域+ 多种未知cDNA 融合表达载体1 同一细胞 融合表达载体2 形成聚合物，启动报告基因的表达 表达载体共转化 4.6 其他方法 构建转座子突变库 噬菌体外显 内含子归槽突变 开放读框顺序标签 第四讲 基因组序列诠释 5. 转录物组 6. 蛋白质组 问题 细胞周期的不同时期 个体发育不同阶段 不同的器官和组织 不同的外界环境下 各种基因的表达与否、量的差异、表达部位如何 5. 转录物组 5.1 Northern杂交 杂交主要步骤： 提取总RNA（不同组织、不同器官） ↓ 变性电泳 ↓ 制备目的基因探针 转移尼龙膜 （放射性 或 化学标记法）