9.高效液相色谱研讨.ppt

1.高效液相色谱法定义 经典液相色谱法，流动相在常压下输送，分析周期长。 高效液相色谱法流动相改为高压输送（最高输送压力可达3.5?107Pa） 色谱柱是用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱； 柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。 所以称它为高压、高速、高效液相色谱法。 药物分析研究方法 以我国分析试验室杂志中的药物分析综述统计分析见表 3.高效液相色谱法与其他分离方法的比较 1.化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相 a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； 三、 液-液分配色谱 固定相：早期涂渍固定液，固定液易流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C18柱（反相柱）。 如磺酸基和羧酸基可以用于阳离子的分离，季胺盐可以用于阴离子的分离。 以阳离子交换为例 不同的样品阳离子与交换基团的作用力大小不同，电荷密度大的离子与交换基团的作用力大，在树脂中的保留时间就长，于是不同的离子相互分离。 凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography, GFC）： 以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。主要适合于水溶性高分子的分离。 凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography, GPC）： 以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的测定。 (2) 脱气装置流动相为什么要脱气 流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。 气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。 气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。 气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。 溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。 脱气方法　　 离线超声波振荡脱气和在线真空脱气。a. 超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10-20min。 这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操作的要求，所以，目前仍广泛采用。 b. 真空脱气装置 将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。 一般的真空脱气装置有多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。 为什么要进行梯度洗脱？　　在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。 为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。 梯度洗脱操作　　在液相色谱中流速（压力）梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。 定义：流动相中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变流动相的配比和极性，以提高分离效果。 例如，甲醇-水40:60到45:55到50:50 优点：分离时间缩短，分辨能力增加，峰形改善 混合就在比例阀中完成。因为比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置。 (6) 检测器 b. 荧光检测器（Fluorescence detector） 　原理： 许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。 荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。 有的有机化合物虽然本身不产生荧光，但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。 D.示差折光检测器 (RID) 又称折射率检测器。原理：基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。 绝大多数物质的折射率与流动相都有差异，所以RI是一种通用的检测方法。 虽然其灵敏度比其他检测方法相比要低1-3个数量级。对于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的。 在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也经常使用。 E.蒸发散射光检测器（ ELSD） 　　ELSD是基于溶质的光散射性质的检测器。由雾化器