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DNS-氨基酸的双向聚酰胺薄膜层析 凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白;背 景;;层析的两种相;按层析过程的机理分类： 分配层析: 根据不同组分在不同溶剂中分配系数不同而使物质分离的方法称为分配层析。 吸附层析:吸附是两相成一界面，溶质在表面密集的现象。以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术称为吸附层析。常用吸附剂：活性碳、硅。 离子交换层析: 是以离子交换剂为固定相，根据物质酸碱度、极性和分子大小差异而将物质予以分离的一种方法。 凝胶层析（分子筛）利用凝胶颗粒形成具有三维空间多孔性网络结构的物质，不带电荷，可起滤过或“筛”的作用。 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力的层析技术。;层析法分类;层析法分类;吸附层析;分配层析技术 （液-液层析法）;分配层析技术;分配层析技术;凝胶层析技术;凝胶层析的原理 分子大小不同混合物上柱； 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外； 大小分子分开： 大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中。;;凝胶层析的基本概念;;当分子的Kd＝0时，Ve＝Vo即该分子被完全排阻于凝胶颗粒之外，全部分布于流动相里，固定相里分布为零（A)； 当分子的Kd＝1时，Ve＝Vo+Vi即该分子完全不被排阻，均匀的分布在流动相和固定相里，两相比值为1(C)； 当0 Kd 1时， Ve = Vo + Kd*Vi即表明分子受到部分排阻(B)。;原理 聚酰胺薄膜层析是一类特殊的分配层析。混合物随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于被分离物质与薄膜形成氢键，而各物质形成氢键的能力不同，决定吸附力的差异，吸附力强,展层速度慢，吸附力弱，展层速度快。 展层溶剂与被分离物质在聚酰胺离子表面竞争形成氢键，选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数有最大差异。易溶于展层剂的所受的动力作用大，展层速度快，反之，速度慢。;本实验中，聚酰胺上的氨基与氨基酸（AA）的羰基形成氢键，酰胺基团上羰基与AA中羟基或酚基形成氢键。由于有些AA结构相似，如只采用一种溶剂系统进行单向层析，难达到完全分离的目的。因此可选择另一溶剂系统进行第二向层析。这种层析方法称为双向层析。 第一向：苯－冰醋酸溶剂 第二向：甲酸－水 显色：二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）可与氨基酸的游离氨基结合成DNS-氨基酸。形成的DNS-氨基酸在紫外光下呈黄色荧光。 ;实验操作;3、操作注意事项： 严格控制点样位置以及点样直径。 展层时勿将点样点浸入展层剂中。 展层后必须经电吹风将膜吹干。 紫外光对眼睛有害不要把头伸到灯下观察。;;实验原理 由于Hb（红色，分子量64500）与二硝苯-鱼精蛋白（黄色，分子量2000-12000）的分子量不同，通过交联葡聚糖凝胶G-50（sephadex）层析柱用蒸馏水洗脱分离。从颜色不同可直接观察到血红蛋白洗脱较快，鱼精蛋白洗脱较慢。 ;G类葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖，分子间主要是α-1,6-糖苷键（约占95%），分枝为l,3-糖苷键（约占5%），以1-氯-2,3-环氧丙烷为交联剂将链状结构连接为三维空间的网状结构的高分子化合物。;葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就??小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大。 G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也代表特水量。X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示1g干胶持水2.5ml，G-100表示 1g干胶持水10ml，依次类推。;装柱前准备: 先用自来水洗净,再用蒸馏水洗净,之后往层析柱加入2-3ml蒸馏水,以确保凝胶底部没有气泡； 装柱：垂直装柱，待凝胶装至柱高的10-15cm即可（装柱的时候注意要不断混匀凝胶）。注意防止气泡与分层, 否则重新装柱。可用玻棒搅拌使表面平整； 平衡：反复加蒸馏水,平衡10分钟.使蒸馏水维持在3-4cm高度； 加样：待蒸馏水流至柱平面时（不可使柱平面干掉），马上靠近柱平面小心滴加4滴样品（注意尽量不要使床面搅动），待样品浸入到凝胶中后马上加入3－4滴蒸馏水(动作轻柔)，反复两次，然后加大量蒸馏水洗脱； 收集样品：样品一旦加入后马上用量筒收集流出液，注意向柱床上不断加水，记录红色流出一半时的毫升数（血红蛋白的Ve，也即V