苹果树腐烂病菌.docxVIP

材料和方法 1.1供试菌株孢子的繁殖与制备Preparation of inoculum, apple twigs and inoculation 苹果树腐烂病菌采用青岛农业大学植物病害流行实验室保存的菌株080901-16（含有潮霉素hph和绿色荧光蛋白表达基因gfp），活化前在4℃冰箱中保存。 参考赵红的方法诱导苹果树腐烂病菌产生分生孢子，将病菌置于PDA培养基中，25℃黑暗培养3天，取菌落边缘直径5mm新鲜菌饼20枚，置于大麦粒培养基，25℃恒温箱中培养15天左右可见大量分生孢子器的产生。用1%的琼脂25℃保湿大麦粒，3天即可见到橘黄色分生孢子角溢出。挑取新鲜分生孢子角置于纯净水中，配成106个/ml孢子悬浮液备用。 供试轮纹病菌LXS030101于2008年采自山东莱阳水沐头村的苹果园，‘富士’苹果枝条病瘤上的单孢分离菌株,活化前在4℃冰箱内保存。将轮纹病菌在PDA培养基上活化后接种于富士苹果幼果，幼果发病后3~5天即可产生大量分生孢子，将新鲜的分生孢子用纯净水配置成105个/ml孢子悬浮液备用。 1.2露温、露时对腐烂病菌侵染剪锯口的影响 试验设置7个温度处理和7个湿度处理，共49个组合。7个温度为5、10、15、20、25、30和35℃，7个湿度为0、1、3、6、12、24和48h。每个组合处理3个枝条，全部试验重复3次。 剪取 “富士”苹果一年生新鲜健康枝条，将枝条剪成15～20cm小段,3个一组，进行水培。采用喷雾接种法，将腐烂病菌孢子悬浮液均匀喷在枝条的新鲜剪口上，直至有孢子悬浮液流下。接种后套袋保湿至试验露时。枝条取出后，接种端浸沾75%的酒精，立即甩干，然后置于25℃恒温箱中继续培养7天。 处理结束后，将枝条取出，以1cm为单位自接种端将每个枝条分成若干茎段，并将每个茎段按十字交叉法平均分成4份，用PDA分离每个茎段内的腐烂病菌，并在荧光显微镜下观察是否为接种病菌，以此推断腐烂病菌对苹果枝条木质部的侵染速度。 1.4温度对腐烂病菌在木质部内扩展的影响 试验设置7个温度5、10、15、20、25、30和35℃，每个温度处理6个枝条，枝条长度为10~15cm。全部试验重复3次。 将枝条大小均匀分成6个一组，水培，放入25℃恒温箱中，用分生孢子悬浮液喷雾接种，接种后立即用塑料袋保湿至48h后解袋。转入不同温度下继续培养10天，每个温度1组，全部实验重复3次。 处理结束后，将枝条全部取出，以1cm为单位自接种端将每个枝条分成若干茎段，并将每个茎段按十字交叉法平均分成4份，用PDA分离每个茎段内的腐烂病菌，并在荧光显微镜下观察是否为接种病菌，以此推断腐烂病菌在苹果枝条木质部内的扩展速度。 1.5 露温、露时湿度对轮纹菌孢子侵染的影响 试验设置10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃6个露温处理， 0h、1h、4h、12h和24h,5个露时处理，共30个组合。每个组合处理3个枝条,全部试验重复3次。选取当年生健康富士苹果枝条，剪除梢部，形成接口后，在树体上生长3~5天，然后剪下枝条，长度15cm，进行水培，用于试验。 采用孢子悬浮液喷雾接种，接种后套袋保湿至试验露时，保湿结束后，在同一温度下晾干10分钟，然后转入同一温度下相对湿度75%相同环境中，培养至72小时。取出枝条，将枝条接种端用0.1%升汞浸泡15s，然后再经过三级水清洗三次后转入温度30℃,湿度为75%的环境中，培养25天，检查枝条的发病情况，以出现0.5cm溃疡斑为标准判定为发病。 2结果 2.1露温、露时对腐烂病菌侵染剪口的影响 结果如图1所示，苹果树腐烂病菌的分生孢子在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃下均能侵染枝条剪口，15℃、20℃、25℃、30℃ 温度处理下的菌丝侵染深度均能达到5cm。35℃的病菌分离率很低，且侵染深度最小，仅为1cm。 腐烂病菌分生孢子在七个温度处理中虽能萌发侵染，但菌丝侵染木质部的深度存在显著差异（P0.05）。15℃、20℃、25℃、30℃的菌丝侵染深度均能达到5cm,显著高于其他温度处理（表1）。 方差分析结果表明露温对腐烂病菌侵染剪口的影响显著，露时对腐烂病菌侵染剪口的影响不显著。在7个露时处理中，分生孢子均能侵染枝条剪口，且病菌分离率无较大差异。在露温和露时两个处理因子中，露温是影响腐烂病菌侵染剪口的重要因子，露时对腐烂病菌侵染剪口没有显著影响，露温和露时交互作用对腐烂病菌侵染剪口也无显著影响。 不同露温、露时下的腐烂病菌侵染剪口的病菌分离率P可用如下模型描述（图2） P=-(14.342±8.657)+( 37.273±9.922)T-(9.467±2.424)T2 R-square=0.7931 根据上述试验结果，20℃下分离获得的组织带菌率最高。推测20 表1露温、露时对对