第二章高效液相色谱法研讨.ppt

第二章 高效液相色谱法; 目的要求： 1. 熟悉HPLC法的基本原理和测试技术。 2. 掌握HPLC法色谱条件选择、定性定量分析方法。 3. 了解HPLC法在中药研究中的应用。 ;主要参考书：; 第一节 绪 论;一、HPLC与经典LC区别; 2．HPLC：既可分离又可分析手段 高压输送流动相 固定相粒度小且均匀，粒径10μm（全多孔球形微粒，匀 浆装柱），柱内径2～6mm，溶质在固定相的传质、扩散速 度大大加快，柱效高（H↓，n↑），色谱柱可反复使用 分析周期短 可以在线检测 灵敏度高，如UVD的最小测定量可达10－9 g ，FD的灵敏度 可达10－11 g;二、HPLC与GC差别;2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体，组分与流动相无亲合 作用力，只与固定相作用。且载气种类少，性 质接近，改变载气对柱效和分离效率影响小。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用 力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因 素，对分离起很大作用。流动相种类较多，可 供选择范围广，流动相极性和pH值的选择，是 控制柱效和分离效率的重要因素之一，选用不 同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以 增大分离选择性。 ; 3. 固定相差别 GC： 多是固体吸附剂或在担体表面上涂渍液 体的固定相，且粒度粗。 HPLC：大都是新型的固体吸附剂、化学键合相 等，粒度小（一般1.7～10μm）。 4．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）;三、HPLC的特点和应用 “三高” “一快” “一广” 高柱效（n=104片/米，远高于LC），高灵敏度，高 选择性，分析速度快，应用范围广泛，可以分析80%以上 的有机化合物，如生命科学、生物工程，环境科学、中 医中药及现代医学等领域的基础研究和应用工作中，都 离不开各种类型的HPLC色谱仪。 另外，流出组分容易收集，操作可以自动化，使用安 全，亦可用于样品的纯化制备（制备型HPLC仪） 。; 四、HPLC法的局限性 流动相用的多种溶剂，较GC法成本高 易引起环境污染 梯度洗脱比GC法的程序升温操作复杂 不能分析高压下易分解、变性的具有活性的生化样品 ; 第二节 高效液相色谱仪 ;六通法进样器;岛津Lc-2010HT HPLC仪; ;（二）脱气装置 作用：排除气泡，减小基线噪音、不影响检测和不破 坏色谱柱。 常见的脱气方法有： 1．超声波振荡脱气法：10～30min/500ml ，不影响组成 各种溶剂 常用 2．抽 真 空 脱 气 法：真空泵 单一溶剂 常用（同时完成过滤和 脱气双重任务） 3．加热回流脱气法 ：电化学检测器 单一溶剂 4．吹 氦 脱 气 法：吹入氦气，使流动相中溶解的空气排除， 成本高 ，不实用 5．在线真空脱气法：在线脱气，脱气效果优于前几种方法，适用 于多元溶剂体系。;（三）输液泵 作用：把样品带入到色谱柱中，使样品在固定相和 和流动相之间作用来实现分离。 恒压泵－－流量精度不稳 恒流泵－－常用，柱塞往复泵 柱塞往复泵：输液的脉冲性较大 。 双泵补偿法 ：由两个柱塞往复泵串联或并联 ，两 个泵的柱塞运动方向相反，克服了输液的脉冲性 ，使流速稳定。; 输液泵必须具备以下功能和性能： 1. 耐高压 :平均粒径3～5μm，内径3～5mm的 色谱柱，流动相流速1～3mL/min，最高工作压 力达到34.47～41.36MPa。 对于1～2.5μm的小粒径无孔色谱的应用，耐受压 力的要求更高。 2. 输液平稳脉动小：平稳连续的输液，脉动比较 小，才能够保证分离的重复性。 ; 3. 流量范围宽，且连续可调 常规分析要求的流量范围一般为0.010～10 mL/min ，甚至到0.001mL/min。 制备分