NFkBp65siRNA对口腔鳞癌细胞株Tac8113增殖、凋亡与耐药的影响.pdf

NF-κBp65 siRNA 对口腔鳞癌 Tac8113 细胞株增殖、 凋亡和耐药的影响 摘 要 目的：应用siRNA干扰口腔鳞癌Tac8113细胞株内NF-κBp65基因的表 达，同时联合应用化疗药物5-Fu，观察NF-κBp65 siRNA对口腔鳞癌Tac8113 细胞株增殖、凋亡和耐药的影响，拟为口腔鳞癌的靶向治疗提供新思路。 方法：体外培养Tac8113细胞，并分为三组：①空白对照组；②阴性对照组； ③实验组。1. 构建NF-κBp65 siRNA，瞬时转染口腔鳞癌Tac8113细胞，应 用荧光显微镜观察Tac8113细胞的转染情况，并计算细胞转染率；2. 应用 半定量RT-PCR法检测转染后对Tac8113细胞内NF-κBp65 mRNA表达水平 的影响；3. 应用ELISA法检测转染对Tac8113细胞内NF-κBp65蛋白表达水 平的影响；4. 应用MTT法检测转染后对Tac8113细胞增殖??影响；5. 应用 流式细胞仪（Annexin V-FITC/PI法）检测转染后对Tac8113细胞凋亡的影响； 6. 转染后将细胞分为未转染组（空白对照组）和转染组，联合应用不同浓 度的化疗药物5-Fu（0mg/L、16.35 mg/L、32.7 mg/L、327 mg/L、3270 mg/L、 6540 mg/L），培养48h，观察转染后Tac8113细胞对化疗药物5-Fu敏感性的 影响。结果：1. 应用荧光标记的NF-κBp65 siRNA转染Tac8113细胞，转染 后24h，荧光显微镜观察发现多数实验组细胞胞核内有绿色荧光信号存在， 细胞转染率约为61%；2.半定量 RT-PCR检测结果显示，转染后48h，空白 对照组、阴性对照组、实验组细胞内NF-κBp65 mRNA的相对表达量分别为 0.539±0.036、0.514±0.031、0.313±0.031，实验组细胞内NF-κBp65 mRNA 的相对表达量与空白对照组和阴性对照组相比明显减少，差异具有统计学 1 意义（P0.05）；3. ELISA检测结果显示，转染后48h，空白对照组、阴性 对照组、实 验 组 Tca8113 细胞内NF-κBp65 蛋 白 的 相 对 表 达 量 分 别 为 1.165±0.074、1.182±0.049、1.002± 0.055(ng/ml)，与空白对照组和阴性对照 组相比实验组细胞内NF-κBp65 蛋白的相对表达量明显减少，差异具有统 计学意义（P0.05）；4. MTT检测结果显示，在各时间段内实验组Tac8113 细胞生长缓慢，实验组细胞的增殖活性与空白对照组和阴性对照组的比较 明显降低，细胞增殖明显受到抑制,差异具有统计学意义（P0.05），且在 转染后第72h抑制作用最大，细胞抑制率达到28.1%； 5.流式细胞仪检测结 果显示，转染后72h ，三组细胞的细胞凋亡率分别为 (8.50±0.92)%、 (8.39±1.03)%、(24.58±2.31)%，实验组细胞的凋亡率要明显高于两个对照 组，差异具有统计学意义（P0.05），且实验组细胞的早期凋亡率升高幅度 要大于晚期凋亡率；6. 转染后联合应用不同浓度的5-Fu , MTT检测结果显 示，转染后72h，未转染组和转染组细胞的增殖活性随着浓度的升高都有下 降趋势，但同一浓度内转染组细胞的增殖活性下降得要比未转染组细胞更 加明显，差异具有统计学意义（P0.05），即转染后Tca8113细胞对化疗药 物5-Fu的敏感性明显升高。结论：1.NF-κBp65 siRNA可有效地转染口腔鳞 癌Tac8113细胞。2. 转染后NF-κBp65 mRNA和蛋白的表达量明显减少，结 果提示NF-κBp65 siRNA沉默了Tac8113细胞内NF-κBp65基因的表达。3. 沉 默NF-κBp65 基因可抑制Tac8113细胞的生长增殖，并且可诱导Tac