生化试验-电泳技术浅析.pptVIP

电 泳 技 术; ;1. 电泳技术的基本原理;2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。 ①凝胶孔径不连续性 ②缓冲液离子成份的不连续性 ③PH的不连续性;2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS- PAGE）;SDS测蛋白质分子量的原理： ;SDS的作用： 1）各种SDS-Pr均带相同密度的负电荷，超过了原Pr所带电荷，因而消除了不同Pr电荷差异。 2）加入SDS，打开氢键和疏水键，改变了Pr的构象，SDS-Pr均为棒状结构，因而消除了不同Pr构象差异。 ;3. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS- PAGE）; SDS-Pr的电泳迁移率主要取决于Pr的分子量，而与Pr所带电荷和形状无关，因此，可利用SDS测定Pr分子量。 《Pr分子量的对数与相对迁移率成正比》 1gMr = k- bmR 式中：Mr为蛋白质的分子量；k为截距，b为斜率，mR为相对迁移率（样品迁移距离/染料迁移距离） ;利用系列标准蛋白绘制标准曲线; 在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制得完全一致，因此，用SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。 ;;4. 等电聚焦 (Isoelectro focusing IEF or EF);原理 3）如果Pr发生扩散，附近的凝胶会使其荷电，阳、阴极会重新吸引它回到 pI位置。因此Pr只能在 pI位置被浓缩成窄、稳定的带。这种浓缩效应称为聚焦。 4）只要凝胶中的pH梯度范围足够窄，便可将pI相近的Pr分开。EF是电泳技术中分辨率最高的技术。;;pH梯度凝胶的制备（EF的关键） ⑴在凝胶制备过程中，加两性电解质载体，通电后即形成pH梯度。分辨率可达0.01pH ⑵固相pH梯度(1975年)IPG， 以具弱酸或弱碱性质的丙稀酰胺衍生物形成缓冲体系。分辨率可达0.001pH。 ;;;5. 双向凝胶电泳（二维电泳）;方法 ⑴利用毛细管或IPG胶条，进行等电聚焦电泳。 ⑵取出胶条。 ⑶将胶条放于垂直板凝胶顶部。 ⑷进行SDS电泳。;5. 双向凝胶电泳（二维电泳）;Latex beads were internalized by J774 macrophages for 60 min followed by a 60-min incubation without bead. After cell breakage, phagosomes were isolated on sucrose gradients and their proteins separated by high-resolution 2-D gel electrophoresis. Proteins were separated according to their isoelectric point on immobilized pH-gradients 3-10, and then by standard SDS. The major spots were excised and analyzed by mass spectrometry. The image used here is a representative gel stained with silver.;J. Garin et al. (2001), J. C. B., 152, 165-180;凝胶干燥技术 凝胶扫描技术借助薄层扫描仪对电泳图谱扫描，以迁移率为横坐标，以吸光度为纵坐标，将电泳条带转换成峰图。 凝胶成像技术通过图像采集和图像分析，利用计算机程序自动识别图中所有可能条带。 凝胶印渍转移技术Southern Blot，Northern Blot，Western Blot ; 本次实验利用SDS方法检测层析液中的抗体;利用SDS方法检测层析液中的抗体;【原理】 1、抗体IgG由两条重链（分别为50kD）和两条轻链（分别为25kD）组成。 2、 SDS能确定样品中蛋白质的分子量。 【流程】 1、从各收集管中取出部分样品，进行SDS电泳。 2、利用标准蛋白样品的分子量和迁移率，绘制标准曲线。 3、根据各收集管中蛋白的迁移率，计算分子量。 4、根据各收集管中是否同时含有50kD和25kD的条带，确定该管中是否含有抗体，;;【预期检测结果】;NaCl浓度 ;操作步骤 1：清洗玻璃板，组装（按上次实验分组，每组制