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一、TUNEL试剂盒说明 凯基一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法，可检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是绿色荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3－OH末端，可用荧光显微镜检测。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被标记。 本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞。 本试剂盒特点 ● 操作简便：使用Ready-to-Use型试剂，只需一步染色反应，洗涤后即可观察。 ● 高灵敏度：可以单一检出初期的凋亡细胞。 ● 高特异性：能特异性染色凋亡细胞。 ● 快速操作：仅需约1-2个小时即可完成整体操作。 ● 方便观察：可使用荧光显微镜观察实验结果。 ● 高正确性：有阳性对照片的制备方法，可以确认试剂盒的有效性 ● 应用范围广：可以用于冷冻或石蜡切片中的组织细胞凋亡检测，也可检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。 二、TUNEL试剂盒组分 组 份Cat: KGA-7071 20 assaysCat: KGA-7072 50 assaysCat: KGA-7073 100 assays储存条件Equilibration Buffer1.0 mL2.5 mL5.0 mL-20℃FITC-12-dUTP20μL50μL100μL-20℃TdT Enzyme80μL200μL400μL-20℃50×Proteinase K40μL100μL200μL-20℃注意事项 1． 使用前请认真阅读本说明书，提前准备好相关试剂。 2． 因本试剂盒中组分均为微量，使用前请离心集液。 3． 为避免试验误差、降低试剂的损耗，建议使用精密度高的进口微量移液枪及枪头。 4． TdT 酶反应液最好在使用前根椐样本数量集中配制，再分别滴加于各样本片上，避免每个样本单独配制而产生的试剂损耗。 5. 用户自备：二甲苯、多聚甲醛、PBS、H2O2 、TritonX-100、柠檬酸钠、盖玻片、载玻片、染色缸。 三、 操作流程概览 细胞涂片、贴壁细胞爬片等细胞样本 四、 检测样本的预处理 TUNEL检测时样本的预处理是试验的关键所在，本说明书推荐的条件仅为普遍情况，用户需根椐自已的样本材料及首次试验结果来调整各个条件（参照Page 10），如处理时间、处理浓度等，来优化出适合自身样本的试验条件，从而做出客观的试验结果。 1． 细胞样本的准备. 操作注意事项： 1. 为防止样本脱落，请使用硅烷（Silane）处理的载玻片或采用多聚赖氨酸铺片。 2. 固定好的样本可以在-20℃的70%乙醇中放置30分钟～一晚，以改善细胞的渗透性。 3. 使用PBS清洗细胞样本时，不要直接加在细胞样本上，以防止细胞样本的脱落。 4. 进行PBS清洗时，以5分钟清洗3次为标准。 5. 固定液、PBS、封闭液、通透液、染色缸需用户自备，请按上述方法配制。 2． 石蜡组织切片的预处理 * 注意事项：蛋白酶K处理的使用浓度、处理时间及温度，都因组织的类型不同而有所不同，需要自已摸索优化上述条件，如有问题，请根椐本说明书Page 10的《常见问题的原因及推荐解决方案》来调整条件。例如：如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的Proteinase K（400μg/mL）处理, /SPAN5分钟。（本试剂盒的50×Proteinase K浓度为1mg/mL）。 其它替代方法： 石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶K处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同： 替代方法1: 将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10 min（通透液：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制） 替代方法2： 将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10 min（胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于HCl PH2，胰蛋白酶0.25%-0.5%溶于0.01N HCl ） 替代方法3: 将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml 0.1M的柠檬酸缓冲液PH 6 的塑料盒中，置于微波炉中350W（低档）处理5 min。 3.????? 冰冻切片的预处理 4. 其它难于处理的组织切片的预处理 5. 阳性对照及阴性对照的准备 TUNEL检测同时需要设阳性和阴性对照，以显示试验的客观性及准确性。因此