蛋白酶液化淀粉酶活力的测定详解.pptVIP

第八节 蛋白酶活力的测定;1、酶的定义 酶是由生物活细胞产生的有催化功能的蛋白质，只要不处于变性状态，无论在细胞内或细胞外都可发挥催化化学反应的作用。 酶及辅酶 有些酶是简单蛋白质，有些酶是结合蛋白质，一般把结合蛋白质的蛋白部分称为酶蛋白，非蛋白质部分称为辅酶。;（二）酶活力的测定意义 ;（三）酶活力的概念： 指酶催化特定化学反应的能力。其大小通常用在一定条件下酶催化某一特定化学反应的速度来表示。一定量的酶制剂催化某一化学反应速度快，活力大；反之，活力小。速度表示法常用-dS/dt或dP/dt，测初速度，多用后者。因为反应初期底物过量，底物的减少量不容易测定，而产物从无到有，易测定。 酶活力又称酶活性。;（四）酶的活力单位;③习惯单位: 在实际使用中,不同酶有各自的规定,如: 糖化酶活力单位:在规定条件下,每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为1个酶单位。 蛋白酶活力单位：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量。;（五）酶的比活力;（六）酶活力测定的基本原理; 在测定酶活力时，对反应温度、pH值、底物浓度、作用时间都有统一规定，以便同类产品互相比较。 酶单位并不直接反映出酶的绝对数量，它只不过是一种相对比较的依据。 ;在评价纯化酶的操作方法是优劣时，要同时考虑两个概念： 纯化倍数与回收率 纯化倍数=某纯化操作后的比活力/第一步操作后的比活力 回收率=某纯化操作后的总活力/第一步操作后的总活力  ;（七）酶活力的测定方法（动力学法） 酶活力与底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂、抑制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测定可用终止反应法或连续反应法（动力学法）。 1 终止反应法(Stopped Method) 终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停止，取出反应物或产物，予以分离，再确定反府物的消耗量，或产物的形成量，算出酶活性。产物的测定方法可用酶法、化学法或放射化学法。 使酶停止作用常用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也可用SDS）使酶失活或加热??酶变性等。;（1）酶法 酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例如葡萄糖氧化酶催化的下列反应： 葡萄糖+O2→葡萄糖内脂+H2O2 欲测定葡萄糖内脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧化物酶和木酚，使发生下列反应:; 由于4—甲氧联酚在435nm波长处有光吸收峰，因此、只要测定A435，就可知4—甲氧联酚的量，可得H202的量，从而可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶(过氧化物酶)必须过量，否则，将出现下图的情况。一般偶联酶量最少也应在5倍以上。 ;再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）： 　　　　　葡萄糖＋ATP→葡萄糖-6-P 其偶联-指示剂 为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 葡萄糖-6-P+NADP+ →6-P-葡萄糖酸+NADPH+H+ 这时即可测定340nm处光吸收的增加得到己糖激酶（或葡萄糖激酶）的活性. 酶偶联测定法可用分开的也可用连续的反应系统进行。 （2）化学法 化学法是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理方法测出NH3和CO2，然后用比色法、滴定法、气体体积量度法等方法测出酶活性.;化学分析法的优点是:不需要特殊仪器,一般有恒温水浴、滴定管、离心机及比色计或分光光度计即可进行工作。对于绝大多数的酶，都可根据底物及产物的化学性质，设计具体的测定方法，应用范围较广。 缺点是：由于测定结果是根据间隔一定时间取样所得，取样过多，则总的工作量较大，取样过少，则不能得到酶反应过程的全貌，并且在实际操作过程中，取样及停止时间不容易准确控制，因此对于反应较快的酶反应，结果不够准确。 目前，市场上已有酶反应仪商品，可将不同时间取样、停止反应、加入反应试剂、保温、比色或其他测定方法编排成程序，自动的依次完成，并将其结果打印输出。所以现在对化学分析法必须作出新的评价。;（3）放射性化学法;2 连续反应法(Continuous Method) 连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中的光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化用仪器跟踪检测反应进行的过程，记录结果，算出酶活性，连续法使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不能用该法测定。 （1）一般的连续法：包括光谱吸收、电化学、量气、量热、旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光度和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，