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专题一 基因工程与细胞工程;DNA连接酶;(江苏卷,2T)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题:;(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后,分别含有________个游离的磷酸基团。
(2)若对图中质粒进行改造,插入的SmaⅠ酶切位点越多,质粒的热稳定性越________。
(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒,不能使用Sma Ⅰ切割,原因是__________________________________________________
__________________。
(4)与只使用EcoRⅠ相比较,使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止________________
____________________。
;(5)为了获取重组质粒,将切割后的质粒与目的基因片段混合,并加入________酶。
(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了________。
(7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因,将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体,然后在________的培养基中培养,以完成目的基因表达的初步检测。;解析 本题综合考查基因工程的过程及应用。(1)质粒是双链环状DNA分子,在Sma Ⅰ切割前没有游离的磷酸基团,Sma Ⅰ作用于两个核苷酸之间的磷酸二酯键,切割产生的DNA片段末端是平末端,因而质粒经切割后含有2个游离的磷酸基团。(2)质粒的热稳定性主要由氢键的数量决定,氢键数量越多,质粒的热稳定性越高,反之则低,DNA双链中A与T之间存在2个氢键,C与G之间存在3个氢键,因此DNA分子中G—C碱基对越多,热稳定性就越高,Sma Ⅰ识别CCCGGG序列,并在C和G之间将这段序列切开,也就是质粒中Sma Ⅰ酶切位点越多,G—C碱基对越多,热稳定性越高。(3)据图1可知,Sma Ⅰ切割的位点在抗生素抗性基因之中,抗生素抗性基因是标记基因,应尽量避免破坏,据图2可知Sma Ⅰ切割的位点在目的基因之中,破坏了目的基因,所以不能使用Sma Ⅰ切割。;(4)用同种限制酶切割后的质粒和目的基因,在基因表达载体构建时,常形成三种连接方式,其中目的基因与目的基因的连接、质粒与质粒的连接是无效的连接,用两种限制酶可避免此类现象。(5)基因表达载体的构建过程中需加DNA连接酶,连接脱氧核糖和磷酸。(6)抗???素抗性基因属于标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。(7)目的基因是蔗糖转运蛋白基因,将其导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体后,应进行目的基因的检测与鉴定,可根据受体细胞是否含有蔗糖转运蛋白,即是否具备吸收蔗糖的能力判断基因工程是否成功,因而可在含有蔗糖(唯一碳源)的培养基中培养。;答案 (1)0、2 (2)高 (3)SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因 (4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化 (5)DNA连接 (6)鉴别和筛选含有目的基因的细胞 (7)蔗糖为唯一含碳营养物质;提分必记的关键点
1.基因工程常考的3种基本工具
限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体。
2.基因表达载体的组成
目的基因+启动子+终止子+标记基因+复制原点等。
3.基因工程的四大操作程序
(1)目的基因的获取(三大方法)
①从基因文库中获取。
②利用PCR技术扩增:其实质是在体外对目的基因进行大量复制。
③用化学方法人工合成;(2)基因表达载体的构建(此为“核心步骤”)。
(3)将目的基因导入受体细胞的“三大方法”:
①导入植物细胞——农杆菌转化法(花粉管通道法、基因枪法)。
②导入动物细胞——显微注射法(导入受精卵)。
③导入微生物细胞——使用Ca2+处理细胞。
(4)目的基因的检测与鉴定;题组1 基因工程的操作工具与操作步骤;解析 限制酶大多是特异性识别6个核苷酸序列,也有的识别4、5或8个核苷酸组成的序列,A错误;DNA聚合酶只是在延伸阶段发挥催化作用,B错误;质粒上一般带有的抗生素抗性基因可作为标记基因,供鉴定和选择,不是抗生素合成基因,C错误;目的基因导入受体细胞后不一定都能正常表达,D正确。
答案 ABC;2.(2015·江苏卷,32)胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。图1是该方法所用的基因表达载体,图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B分别表示β-半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合的蛋白)。请回答下列问题:
图1
;图2
(1)图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是________。
(2)图1中启动子是________酶识别和结合的部位,有了它才能启动目的基因的表达;氨苄青霉素抗性基因的作用是____________________
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