第六章 外源基因的表达1.pptVIP

第六章 外源基因的表达;遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（central dogma）。 ; 克隆基因的表达：; 最佳的基因表达体系： 目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。 ;;1 基因表达的机制;1.1 外源基因的起始转录 ;原核生物启动子;1.2 mRNA的延伸与稳定; mRNA的稳定性直接决定翻译产物的多少。 对原核细胞来说，最佳的方法是选择一个RNase缺失的受体菌。 真核细胞来说，则需要考虑增加mRNA的正确加工，提高成熟mRNA的稳定性。 ;1 基因表达的机制;1.3 外源基因mRNA的有效翻译;不同基因组使用密码子具有选择性。;1 基因表达的机制;1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性;1 基因表达的机制;1.5 目的基因沉默;共抑制（cosuppression）是转录后水平的基因沉默的一种，指被整合的外源基因沉默的同时，与其同源的内源DNA的表达也受到抑制。;;2 基因表达的调控元件;2.1 启动子;TTGACA;RNA pol II;2 基因表达的调控元件; 2.2 增强子;2 基因表达的调控元件;2.3 终止子;2.4 衰减子;;色氨酸浓度高时;2.5 绝缘子; 2.6 反义子;;; 3 外源基因表达系统; 3.1 大肠杆菌基因表达系统;;3.1.1 大肠杆菌基因表达载体;大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：;（1）DNA复制及重组载体的选择系统;选择标记;大肠杆菌基因表达载体的3个系统：;（2）外源目的基因的转录系统;P tac = 3 P trp = 11 P lac;转录终止子;大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：;（3）蛋白质的翻译系统;核糖体结合位点（ RBS）;翻译起始密码子;翻译终止密码子;主要密码子和稀有密码子 如果外源目的基因mRNA的主密码子和受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之，若外源基因含有较多的稀有密码子，其表达水平就低。 因此，在构建大肠杆菌表达载体时，要考虑所表达基因的种类和性质，或对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上的调控序列进行适当的调整。;;;常见的大肠杆菌基因表达受体菌株;;3.1.3 常见的大肠杆菌表达系统;;3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式;3.1.4 外源基因在大肠杆菌表达的形式 A）包涵体型异源蛋白 包涵体：在一定条件下，外源基因的表达产物在细胞中累积，致密地积聚在细胞内或被膜包裹或形成无膜裸露的结构。 结构特点：具有正确的氨基酸序列，但空间结构是错误的，无生物学活性。 优点：简化了外源基因表达产物的分离纯化程序。;B）融合型异源蛋白 融合蛋白：外源蛋白基因和受体菌自身蛋白基因重组在一起，不改变两个基因阅读框。 受体菌蛋白位于N端，外源蛋白在C端。 特点：受体菌蛋白与异源蛋白形成良好的杂合构象，使得多肽链上的蛋白酶切位点隐藏在蛋白分子内部而不易被切割，因而大大增加了产物的稳定性。;C）寡聚型异源蛋白 在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串连在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋白。;D）整合型异源蛋白 将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表达的外源蛋白即为整合型外源蛋白。 外源基因与宿主染色体整合是根据DNA同源交换的原理 ;E）分泌型蛋白;;3.1.5 外源基因的高效表达策略; 3 外源基因表达系统;;4.1 基因表达产物的检测;4.1.1 外源基因转录产物的检测－Northern杂交 4.1.2 报告基因的酶法检测： β-葡萄糖苷酸酶基因（gus基因??、氯霉素乙酰转移酶基因（cat基因）、冠瘿碱合成酶基因、抗卡那霉素基因（npt-Ⅱ基因）等。 4.1.3 免疫学检测 免疫沉淀法 酶联免疫吸附法 Western印迹法 固相放射免疫法 4.1.4 表达产物生物学活性检测;4.2 基因表达产物的分离纯化;4.2.2 离心;4.2.3 特异性表达蛋白的初步分离;4.2.4 柱层析;4.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳;基因工程总结; 基因工程应用;小结： 1、基因表达的基本过程(转录-翻译) 与表达的调节 。 2、原核与真核生物启动子的主要构成。 3、主要的表达系统：大肠杆菌、酵母、植物、动物。 4、表达产物的检测与分离等。