第三章 培养用液.ppt

　　　 　　　　 第三章 培 养 用 液; 培养用液是维护组织细胞生存、生长及进 行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶 液。 主要包括　平衡盐溶液 　　　　　　培养基 　 　　　　　　其他培养用液 　;　　第一节 水和平衡盐溶液;2、平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS） 　 组织细胞培养中常用的基本液体。 用途： 取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。 注意： 配制平衡盐溶液也应当用纯化水。如果配方中含有Ca2+、Mg 2+，应当首先溶解这些成分。 灭菌方法： 过滤除菌或高温高压灭菌。 ;几种常用的平衡盐溶液： PBS、Hank’s、D-Hank’s （都有相应配方,主要由无机盐、葡萄糖组成） D-Hank’s与Hank’s的一个主要区别在于前者不含有Ca2+、Mg2+ 因此D-Hank’s常用于配制胰酶溶液。 ;PBS（Phosphate-Buffered Sallines） ; D-Hanks’ 平衡盐溶液 (D-Hanks Balanced Salt Solutions);　　　第二节 培养基; 一、培养基中主要的成分;1、天然培养基：即组织提取物和体液。 　　如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。 　 2、合成培养基:需要添加血清培养细胞。 3、无血清培养基 　　不需要添加血清就可维持细胞在体外较长时 　　间生长繁殖的合成培养基。 ;市场上可提供干粉培养基和液体培养基 干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜、保存方便。缺点是配制过程比较繁琐，质量不易控制 液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便，但比较昂贵。 常用的培养基种类 RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys 5A、M199、F10等 ;三、如何选择培养基？;四、培养基的配制： ;　　　DMEM培养液的配制（举例）;　五、血清：;1、血清的主要作用 　(1)提供基本营养物质 　(2)提供贴壁和扩展因子 　(3)提供激素及各种生长因子 　(4)提供结合蛋白 　(5)对培养中的细胞提供某些保护作用 ;2、细胞培养中使用血清的缺点 (1)有可能改变某种细胞在体内的正常状态 (2)血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用 (3)每批血清之间都有差别,其成分不能保持一致。 (4)取材过程有可能带入支原体、病毒，对培养 的细胞产生潜在影响 (5)直接影响某些实验，如生长因子的检测;3、血清质量的判断： 对于使用者来说，血清质量首先从外观入手。好的血清应该是透明清亮，土黄色或棕黄色，无沉淀或极少量沉淀，比较粘稠。 4、血清的使用与储存 　 （1）瓶装血清解冻步骤: -20 ℃ 或–70 ℃ 至4 ℃ 冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡 ，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。 勿直接由－20 ℃ 直接至37 ℃ 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。  ; (2)使用前的处理：血清在使用前通常在56℃加热30分钟，这一过程称为灭活。 　　 热灭活目的：灭活血清中的补体成分。 　 对于一些品质高的胎牛血清和新生牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。  ;（3）储存条件： 血清一般储存于－20℃,同时应避免反复冻融 大包装的血清，首先将血清灭活处理，然后分装为小包装，如10ml、20ml、50ml，储存于 -20℃，使用前融化。 融化后的血清在4℃不宜长时间存放，勿超过一个月，应尽快使用。; （4）血清中的沉淀物 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清;举例;六、其他培养用液 ;一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便 常用工作液浓度为0.02%。注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长 EDTA 溶液配制：用D-Hanks’平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4℃冰箱保存;（3）胶原酶(collagenase)溶液： 使用浓度为0.1～0