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前 言
中心法则:
第一章 PCR
一、概念:
PCR(聚合酶链式反应,Polymerase Chain Reaction)是利用 HYPERLINK /view/758.htm \t _blank DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链,低温(经常是60°C左右)时引物与单链按 HYPERLINK /view/24576.htm \t _blank 碱基互补配对的原则结合,再调 HYPERLINK /view/8193.htm \t _blank 温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右),DNA HYPERLINK /view/1203504.htm \t _blank 聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链。
二、原理:
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至95℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至60℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对原则与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
三、引物
PCR反应中有两条引物,即5′引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准(常以信息链为基准),5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同;3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。
引物设计的基本原则
①引物长度:15-30bp,常用为20bp左右,Tm值在60℃比较好。
②引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。
常用引物设计软件有:Primer Premier5.0 、Vector NTI Suit、DNAstar等
Tm值:
Tm值就是DNA熔解温度,指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。不同序列的DNA,Tm值不同。DNA中G-C含量越高,Tm值越高,成正比关系。
Tm计算公式为:Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
四、示意过程:
例如:Taq Plus DNA Polymerase(P201)
反应体系:
DDWTo 20μlTaq DNA Polymerase (5 U/μl)1U-2U10 × Taq Plus Buffer(with 15mM MgCl2)2μl25mM MgCl2optionaldNTP Mix (10 mM each)0.4μl引物F (10 μM)0.8μl引物R (10 μM)0.8μl模板DNA根据说明书提供的参考浓度选择反应程序:
95℃5 min (预变性)95℃30 sec
30-35循环60℃30 sec72℃60 sec/kb72℃7 min (彻底延伸)
附:DNA与RNA的区别?
1、组成单位不同:DNA的组成单位是脱氧核苷酸,RNA的组成单位是核糖核苷酸,
2、组成碱基不同:DNA的组成碱基是ATGC,RNA的组成碱基是AUGC
3、组成五碳糖不同:DNA的组成五碳糖是脱氧核糖,RNA的组成五碳糖是核糖,
4、空间结构不同:DNA是双螺旋结构,RNA一般是单链。
5、功能不同:DNA是遗传物质,RNA一般在细胞中不作为遗传物质。
第二章 逆转录
一、概念:
逆转录(reverse transcription)是以RNA为模板合成DNA的过程。以DNA为模板合成RNA的过程叫做转录,此过程与该流动方向(DNA到RNA)相反,故称为逆转录。
二、原理:
人们通过体外模拟该过程,以样本中提取的mRNA
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