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总RNA的提取(Trizol法提取)
在收集到生物材料之后,最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存,则应以液氮将生物材料急速冷冻后,储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时,将储存于冷冻柜的材料取出,立即以加入液氮研磨的方式打破细胞,不可以先行解冻,以避免RNase的作用。
提取组织RNA时,每50~100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解;提取细胞RNA时,先离心沉淀细胞,每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后,反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞;
将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟;
在上述EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿,盖上EP管盖子,在手中用力震荡15秒,在室温下(15℃~30℃)放置2~3分钟后,12000g(2℃~8℃)离心15分钟;
取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇,在室温下(15℃~30℃)放置10分钟,12000g(2℃~8℃)离心10分钟;
弃上清,按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤,涡旋混合,7500g(2℃~8℃)离心5分钟,弃上清;
让沉淀的RNA在室温下自然干燥;
用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
PCR
实验室常用DNA聚合酶有三种:TaKaRa TaqTM,TaKaRa EXTaqTM和PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶,保真性较差,但价钱便宜,一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶,具有一定的保真性,而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基,如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶,其特点是保真性极高,扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。
按下列组成在PCR反应管中调制反应液:
TaKaRa TaqTM或TaKaRa EXTaqTM的配方
ReagentQuantity, for 50μl of reaction mixture10X PCR buffer (Mg2+ free)5 μlMgCl2(25mM)如TaKaRa TaqTM加3 μl 如TaKaRa EXTaqTM加4 μl2.5mM dNTP mix4 μl 10μM Primer 上游1 μl10μM Primer下游1 μlTemplate DNA1 μlTaq或EXTaqDNA Polymerase0.25 μlSterile deionized waterUp to 50μlTotal50 μl /SamplePyrobestTM DNA Polymerase的配方
ReagentQuantity, for 50μl of reaction mixture10X Pyrobest buffer 5μl2.5mM dNTP mix4μl 10μM Primer上游1μl10μM Primer 下游1μlTemplate DNA1μlPyrobestTM DNA Polymerase0.25μlSterile deionized waterUp to 50μlTotal50μl /Sample
反应总体积根据实际情况进行调控,可以做20~50μl以节约试剂;
将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中;
如果不用PCR仪的加热盖,在反应混合液的上层加30 ~50μl 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发;
按以下程序进行PCR扩增。
PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异,在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进行优化。
StepTemperature, °C Time, minNumber of cyclesNote起始变性94~951-31变性94~950.5-225-35退火温度比理论退火温度大概低5°C,再根据反应结果优化退火37-700.5-2延伸70-75根据扩增产物的大小每分钟延伸1000bp最终延伸70-75101
反应结束后,抽取扩增样品5μl,用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果,用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻
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