蓝耳病毒含量测定[1]概念.pptVIP

PRRS病毒含量测定病毒制品检测室 猪病组;PRRSV核酸为单股RNA，属动脉炎病毒科动脉炎病毒属。 * 病毒粒子呈球形，20面对称，有囊 膜，无血凝性;PRRSV病毒特性;PRRSV培养和增殖;病毒在猪肺泡巨噬细胞内复制;在Marc-145细胞上的病变现象 ;5d左右，细胞大片裂解脱落（ⅹ100）;病毒含量测定; 病毒含量测定用细胞;3、试剂 3.1 细胞培养液：无血清DMEM细胞培养液；含4%胎牛血清的DMEM细胞培养液；含8%胎牛血清的DMEM细胞培养液； 3.2 血清：胎牛血清 3.3 消化液：0.25%胰蛋白酶+EDTA溶液 3.4 其他：PBS;4、细胞的准备 从液氮中取出Marc-145细胞1支，迅速放入37℃水浴解冻，解冻完全后，1000rpm离心5分钟，倾去上清，将离心沉淀后的细胞用10ml含8%胎牛血清的D-MEM营养液悬浮，分装于1个25cm2细胞培养瓶中，置37℃温箱中培养。连续传2~3代，备用。 ;5、 细胞板的准备 取长满单层的Marc-145细胞（传代后72h左右），倾弃培养液，用PBS洗细胞两次，加入消化液到培养瓶细胞面对侧，翻转培养瓶平放以确保消化液完全覆盖细胞层。静置15～30s，弃去大部分消化液，只保留少量消化液，置37℃温箱。待消化完全后加入少量含8%胎牛血清的DMEM细胞培养液，吹打细胞使其分散，按细胞培养时1：3的体积比例制成细胞悬液（细胞浓度约为15万～20万/ml），混匀，用多道移液器加入96孔细胞培养板中，每孔200μl，置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养。;6、 样品的稀释 将冻干样品先用5ml无血清D-MEM营养液稀释成4头份/ml，再做4倍稀释（即取1ml加入到3ml无血清D-MEM营养液中，即为1头份/ml）。然后再做10倍系列稀释，即0.1ml样品加入到0.9ml无血清D-MEM营养液中，涡旋混合均匀，如此连续稀释，取10-3 、10-4 、10-5 、10-64个稀释度进行测定。 注：样品稀释过程应尽量在低温条件下进行;7、 测定 将稀释好的样品加到制备好的已长成Marc145细胞单层（36-48h，一般不要超过48h）的96孔细胞板上，每个稀释度6孔（为避免边缘孔效应，细胞板四周细胞孔不做检测用），每孔100μl 。同时设立正常细胞对照6孔。加样顺序应按照先加正常细胞对照，再由高稀释度到低稀释度加入细胞板。 细胞培养板置37℃、5%二氧化碳培养箱中吸附1h后，补加含4%胎牛血清的DMEM细胞培养液100μl，置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，连续观察至第5日，判定结果。;8、 TCID50计算