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（2）PCR模板的制备 －核酸提取及纯化;PCR模板制备;PCR模板制备与纯化;PCR模板的使用;2 PCR的模板纯化－核酸提取;　基因组DNA的提取;植物基因组DNA－CTAB法;　CTAB提取缓冲液的经典配方;　CTAB提取缓冲液的改进配方;　CTAB法流程图;; SDS法原理; SDS法DNA提取缓冲液; SDS法流程图 （以动物组织为例） ;基因组DNA－其它方法;　浓盐法： 　　　　　　 　 　有机溶剂抽提法： 　　　　 　 　密度梯度离心法： 　　　　　　　;　非基因组DNA的提取;质粒DNA－碱裂解法;　碱裂解法流程图;质粒DNA－煮沸法;细胞器DNA－差速离心法;DNA提取的基本步骤;材料准备;细胞裂解;核酸分离、纯化;蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理 ;多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。;多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合;基因组DNA的检测;RNA提取的通用方法; 步骤: 材料准备：尽量新鲜。 裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。 纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。 洗涤：70％乙醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。;RNA操作中的要求 抑制RNase活性是提取RNA的关键 在实验中，严格控制内源性和外源性RNase的污染。RNase可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性RNase存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNase也会造成污染。这些外源性的RNase可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳 槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNase 。 ; 一、 防止RNA酶污染的措施 1. ? 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间 2. ? 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用） 3. ? 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。 4. ? 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌 5. ? 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 6. ? 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。;二、常用的RNA酶抑制剂 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。高温条件下分解。 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离???来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 ;RNA的分离和纯化- TRIzol试剂法;RNA的鉴定;影响RNA提取的因素;; 样品破碎及裂解： 根据不同材料选择不同的处理方法： 培养细胞：通常可直接加裂解液裂解 酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁 动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻 样品量适当，保证充分裂解 为减少DNA污染，可