3,5—二硝基水杨酸法测定还原糖资料.pptVIP

3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖 ;掌握还原糖定量测定的原理和方法 。 掌握分光光度计的使用。;;还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及产物，3，5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。 在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在 540nm 波长下测定光密度值查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。 ;（一）仪器 小麦面粉、pH 试纸、容量瓶、玻璃漏斗、移液管、量筒、试管、沸水浴锅 （二）试剂 （1）6mol/l HCl 和 6mol/l NaOH溶液 （2）1mg/ml葡萄糖溶液 准确称取 80℃烘干恒重的分析纯葡萄糖 0.1g，置于小烧杯中加入少量蒸馏水溶解后，移到 100ml 容量瓶中，用蒸馏水定溶至 100ml，混匀，4℃冰箱中保存备用。;（3）3，5—二硝基水杨酸 把 6.3g3，5—二硝基水杨酸溶于 262ml 2 mol/l 的氢氧化钠中将此溶液与500ml 含有 182g 酒石酸钾钠的热水混合，向该溶液中加入 5g 重蒸酚和 5g 亚硫酸钠，充分搅拌溶解待溶液冷却后，用水稀释到 1000ml，存储于棕色瓶中。 ;四、操作步骤;2.向九支试管中分别加入 0.5mlDNS 试剂，充分混合。 3.将九支试管放入沸水浴中加热煮沸 5min。 4.将试管放入盛有冷水的烧杯中冷却。 5.向试管中分别加入 4ml 蒸馏水，充分混合。 6.以空白试管试管作对照，于 540nm 波长下，分别测定各管 OD 值并记录。 7.以每管的吸收值即 OD 值为纵坐标，相对应管的葡萄糖浓度为横坐标作图，得到一条直线，该直线通过零点。 ;（二）还原糖抽提液的制备 1.称取 2g 小麦粉，把它放入一个 100ml 的烧杯中，然后加入 50—60ml 蒸馏水，搅拌均匀。 2.把烧杯放入一个 50℃水浴中保温 30min。 3.拿出烧杯，将烧杯内含物转入一个 100ml 容量瓶中，加水至刻度，充分混匀，过滤之，（滤出液用于测定还原糖）即得还原糖抽提液。 ;（三）样品的酸水解和总糖抽提液的制备 1.把 1g 小麦粉溶于 15ml 水中并加入 10ml 6N 的盐酸溶液混合。 2.将烧杯放入沸水浴中加热煮沸 30min 后，冷却。 3.加入 6N 的氢氧化钠中和烧杯内含物。 4.将中和后的溶液转入一个 100ml 的容量瓶中，加水至刻度，充分混???。 5.将容量瓶中的溶液过滤。 6.取 1ml 滤出液加水至 10ml，即得总糖的抽提液。 ;（四）小麦样品中总糖和还原糖的测定 1.取3支试管，编号分别为 1-3 ，按下表向每支试管中加入试剂。 2.将3支试管放入沸水浴中加热煮沸 5min后，冷却。 3.以空白试管（1号管）作对照，于 540nm 波长下，分别测定各管 OD 值并记录。 ;1、葡萄糖的标准曲线 ;五、计算