HPLC第4节 固定相和流动相.pptVIP

第四节固定相与流动相;一、液相色谱固定相 stationary phases of LC;（一）吸附色谱固定相－硅胶;（二）分配色谱：化学键合固定相;2、按照键合的官能团分类 化学键合相固定相：Si—O—Si—C，Si—O—Si—N （1）非极性键合相- 反相HPLC 十八烷基（C18，ODS）、辛烷基（C8）、乙基、甲基、苯基等 流动相的极性大于固定液的极性 极性大的组分先出峰(tR小)，极性小的组分后出峰( tR大) （2）中等极性键合相 醚基键合相（ETH or ROR’）→正相or反相固定相，视流动相极性而定。 （3）极性键合相：-正相HPLC 氨基、氰基 流动相的极性小于固定液的极性 极性小的组分先出峰(tR小)，极性大的组分后出峰( tR大) （4）离子交换键合相;3、化学键合固定相的特点;4、分离原理 正相键合相色谱 固定相：极性键合相---极性有机基团如胺基（-NH2）、腈基（-CN） 主要靠范德华作用力的定向作用力、诱导作用力及氢键作用力 流动相极性增大，洗脱能力增强，组分的K值减小 反相键合相色谱 固定相：极性较小的键合相，苯基、烷基等 流动相溶剂的极性大于固定相 分离机理：疏溶剂作用理论：组分分子中的非极性部分与极性溶剂产生疏溶剂斥力，与键合相的疏水基团产生疏水缔合作用，产生保留作用；另一方面，组分分子中有极性官能团时，极性部分受到极性溶剂的作用，产生解缔作用并减小其保留作用。;疏溶剂缔合作用示意图 1.烷基键合相 2.溶剂膜 3.组分分子极性部分 4.组分分子非极性部分;决定组分保留值的因素（烷基键合固定相对组分分子的缔合作用和解缔作用能力之差）： ①组分分子结构对保留值的影响： 在反相键合相色谱中，以疏水结构差异为分离依据； 组分的极性越弱，疏水性越强，保留值越大。 ②烷基键合固定相特性对保留值的影响： 固定相提供非极性作用表面，键合到硅胶表面的烷基数量决定组分k的大小。 碳链↑，疏水性↑，键合相的非极性作用的表面积↑ ，组分的保留值↑ ，选择性↑。 ③流动相性质对保留值的影响： 流动相的表面张力↑ ，介电常数↑ ，极性↑ ，此时组分与烷基键合相的缔合作用↑ ，流动相的洗脱强度↓，组分的保留值↑ 。 ;固定相; （三）空间排阻分离固定相;（四）离子交换色谱分离固定相;二、液相色谱的流动相mobile phases of LC;（一）对流动相溶剂的要求;（二）流动相的选择原则;严格脱气 原因：流动相因溶解空气而形成气泡，从而造成： 进入检测器，出现噪音峰； 进入流路or色谱柱会使流速不稳，基线起伏； 溶解的O2会与一些溶剂产生有紫外吸收的化合物； 荧光检测中，溶解的氧会使某些成分荧光淬灭； 引起某些样品的氧化降解或溶液pH值变化。 脱气的方法： 超声振荡脱气、加热（多不用）、抽真空、惰性气体鼓泡吹扫（多用He）、在线真空脱气 过滤： 防止不溶物填塞流路和色谱柱 方法：0.45um的微孔滤膜：水相、有机相;（四）流动相的极性;（五）不同色谱分离方法选用的流动相 P322 采用正相液-液分配分离时： 首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。;反相HPLC中的溶剂优化 反相色谱—极性弱洗脱能力强，组分k减小 溶剂强度 通过改变混合流动相中的溶剂的相对比例，可以改变溶剂强度。流动相中水的比例减少，有机溶剂(如甲醇或乙腈)增加，溶剂强度增加，k值减少。 常用溶剂 甲醇or乙腈or四氢呋喃 + H2O 首先试用一种可能过强的流动相(如甲醇)，在后面的试验中逐渐减小溶剂强度以增大k。当所有谱峰符合1＜k＜20的范围时，从溶剂强度的观点来说，其流动相已接近最佳了。(观察待分离组分的分离度);反相色谱中;21;22;23;24;（六）溶剂的选择性 溶剂与组分分子之间的作用力： 色散作用、偶极作用、氢键作用、介电作用 溶剂的分类 根据分子间的作用力，把常用的溶剂分为8类： 处于同一组的溶剂，在色谱分离中具有相似的选择性；在分组三角形中相差较远的组中的溶剂，其选择性相差较大： 改善选择性 根据组分的性质，选择合适的溶剂。 利用多元溶剂，既可调节K值，又可调节选择性。;;;;（七）不同色谱模式流动相的选择 1、吸附色谱流动相 多用非极性烃类（加己烷、庚烷等）+ 极性溶剂（如CH2Cl2、MeOH、氯仿、异丙醚等） → 改变溶剂强度和选择性 2、分配色谱(键合相色谱)流动相 正相：同吸附色谱 反相：以水为基础溶剂 + 各种与之互溶的有机溶剂（沸点适中、粘度小、稳定、UV吸收小） 水：洗脱能力最弱 有机溶剂：比例增大，洗脱能力增大；多用：MeOH、AcCN、丙酮、THF;3、离子交换色谱 含盐水溶液