02第二章 各种工具酶.ppt

第二章 各种工具酶;内容提要;第一节 限制性核酸内切酶;一、概念;3. 功能;图 细菌的限制系统;细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从而防止限制性内切酶的识别和水解。 ① Dam甲基化酶 在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。 ② Dcm甲基化酶 在CCAGG序列的第2个胞嘧啶C5位引入甲基。;图 细菌的修饰系统;图 甲基化位点：DNA上的 A/C;二、限制性内切酶的命名;限制酶的命名;图 几种重要的限制酶;图 几种限制酶的识别位点;三、限制性内切酶的分类;1. I 型限制性内切酶;（2）切割位点;2. III 型限制性内切酶;3. II型限制性内切酶;图 Ⅱ类酶识别序列特点：回文序列;(3) 平齐末端 blunt end;(4) 粘性末端 sticky end;G?AATTC ;CTGCA?G ;③粘性末端的意义;图 粘性末端连接;;四、同裂酶 Isoschizomers;;五、同尾酶 Isocaudamers;5’-G?GATCC-3’ 3’-CCTAG?G-5’ ;5’-G 3’-CCTAG ;六、限制酶的活性;星号活性: 改变反应条件，导致限制酶的专一性和切割效率的改变。 如EcoR I和BamH I等都有*活性。 使用时要防止星号活性。 ;在低盐、高pH（8）时可识别和切割;七、三类限制酶的特性比较;八、影响限制性酶活性的因素;2. DNA的甲基化程度;3. 温度 Tm;4. 缓冲液 Buffer;九、限制性内切酶酶切图谱;图 完全酶切;图 部分酶切;2. 限制性内切酶图谱;（2）酶切图谱的建立;3. 限制酶酶切图谱的分析;4. 酶切产物的检测;琼脂糖凝胶电泳图谱;第二节 DNA 连接酶 ligase;一、DNA连接酶的种类;二、连接反应的条件;三、连接反应的机理;四、连接反应的温度;五、影响连接反应的因素;第三节 DNA聚合酶;一、常用的DNA聚合酶;二、DNA聚合酶的特点;DNA聚合酶;三、各种DNA聚合酶的用途;（2）用DNA聚合酶I 制备探针;标记;③ DNA聚合酶I 对探针序列的标记放射性同位素标记。 A. 放射性同位素标记 切口转移法(nick translation )： 5’?3’外切酶活性从DNA切口的下一段DNA的5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3’一侧补上一个新的核苷酸。;切口转移法;1.纯化的DNA片段;2. Klenow fragment;（2）主要用途;;;mRNA;3. T4 DNA聚合酶;;T4 DNA聚合酶;（2） T4 DNA聚合酶的用途;酶切中间产生两个末端标记;a. 放射性标记;b. 非放射性标记;纯化的DNA片段;??促生物素标记;ii）地高辛标记;图 试剂盒 (kit);iii）偶联酶及其底物;图 化学发光底物;图 HRPO和AP的显色反应底物;HRPO和AP的显色反应底物;发光反应机理;iv）用非放射性标记探针检测原理;图 非放射性标记探针检测原理;核酸探针杂交筛选法的缺点;4. T7 DNA聚合酶;（3）T7 DNA聚合酶的特点;（3）T7 DNA聚合酶的用途;5. 修饰后的T7 DNA聚合酶;6. 反转录酶：AMV;;RNaseH ;（3）逆转录酶的用途;图 cDNA合成;② 合成DNA探针;