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第八章 外源DNA片段与载体DNA的重组主要有哪几种方法？各自的优缺点？ 黏性末端连接法：. 1同一限制酶切位点连接：单酶切 优点： 黏性末端连接可抑制载体和目的DNA分子的自连，因而可大大提高连接的效率。更重要是不同限制性酶切位点的黏性末端连接可以控制目的DNA和载体DNA的连接方向。 缺点： 载体易自身环化；不易定向克隆；产生串联重组体；难以插入特定的基因；大片段DAN的重组率低， 不同一限制酶切位点连接：双酶切 优点： ① 不必将原有的内切酶失活，可以直接进行重组连接； ②有原有限制性内切酶的重组，载体自连就不会发生，不必用碱性磷酸酶进行处理，从而得到高效连接。 缺点： 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别 平头末端连接法：常用① 同聚物加尾连接 ②人工接头连接等 缺点：1效率很低2平头末端连接常常破坏原有的识别性序列3双向插入，由于平头末端没有粘性末端的碱基互补限制，只要是平头末端均能连接，造成插入方向良种可性。4造成多拷贝外源DNA片段插入载体可能性。 优点::1连上后就能用 。2能把任何片段连接起来 第九章 1转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。 2重组子：含有重组DNA分子的转化细胞。 3酶联免疫吸附测定（ELISA原理： 一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）：与一抗的特异性结合。 酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。 酶联免疫吸附测定（ELISA）步骤： ①抗体制备（普通抗体、酶标记抗体[一抗、二抗]） ②抗体或抗原的包被(固定在固相载体上） ③免疫反应 ④特异性表达产物的检测 具体步骤： 固定样品：将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。 一抗结合：加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 二抗结合：加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。 显色反应：加入???色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。 比色：在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。 ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑 第十章 外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物（目的蛋白）。 包涵体蛋白：在一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构，这种结构称为包涵体。涵体存在部位：细胞质、细胞周质 融合蛋白：将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。①稳定性好；②表达效率高；③较易于分离纯化 寡聚型外源蛋白：为提高外源蛋白表达量，在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串连在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋白. 整合型外源蛋白:为防止外源基因随质粒丢失，将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区上，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表达的外源蛋白即为整合型外源蛋白。 分泌型外源蛋白:外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白. 1基因表达在原核生物与真核生物中的差别和特点： 1）原核生物表达系统 1基因表达是以操纵子的形式进行的。 2当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA; 3与此同时， mRNA立即与核糖体结合转译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被水解掉。 2）真核生物基因表达系统 1转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5′和3′末端后才形成成熟的、有功能的mRNA。 2mRNA只能在细胞质中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化，形成高级结构 2原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点： 1原核生物多为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。 2基因组结构简单，便于基因操作和分析。 3多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。 4生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。 5不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构象。 6 内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。] 3真核细胞表达系统表达外源基因的特点： 真核