细胞培养技术入门.ppt

细胞培养技术入门;;在细胞培养中注意的一些问题;1.培养室和超净台的消毒 ★ 培养室 无菌培养室每天都要用速消净或0.2％的新洁而灭（苯扎溴铵）拖洗地面一次（拖布要专用），紫外线照射消毒30～50min。 ;;2. 培养前准备 在开始实验前要制定好详细的实验计划和操作程序，有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置到培养室、超净台内，然后开始消毒。这样可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。 ;; 培养实验用品的前期处理 1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿:新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面呈碱性，并带有一些如铅和砷等对细胞有毒的物质，使用前必须彻底清洗。首先用自来水初步刷洗，5％稀盐酸溶液中浸泡过夜。然后用流水彻底冲洗3-5遍，单蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸水漂洗2遍，烘干备用。; （2)塑料器皿:塑料器皿经冲净后，晾干，用2％NaOH浸泡过夜，自来水冲洗，5％盐酸浸泡30min，流水彻底冲洗3-5遍，单蒸馏水漂洗3遍，三（双）蒸水漂洗2遍，烘干备用。针头式滤器不能泡酸液,用2％NaOH泡6～12小时,或者煮沸20分钟,常规冲洗干净，烘干（60℃以下）备用。使用前要包装，首先要装好滤膜，安装时注意光面朝上(凹向上)，然后用注射器回抽注入检查膜是否破损，安装好膜后将螺旋稍微;; 2.包装： 在消毒前必须进行严格包装，以便消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等。 ;3.消毒: 在组织细胞培养技术中，务必保证组织细胞在无微生物的条件下生长。防止培养物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微生物去除）和无菌操作技术（防止已经消毒灭菌的用品被污染）来完成。;（1）消毒灭菌的方法 : ★ 物理方法: 湿热（高压蒸汽）、干热、紫外线照射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物.  ★ 化学方法:使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。; (2)消毒灭菌的时间： ★ 干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到 160℃，保持90～120 min方能杀死芽孢。消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。 ;;;★ 紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作 台表面及桌椅等消毒。时间为30min－2h左右。 ★ 过滤除菌消毒：适用于组织细胞培养使用的液体 如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。 ;4.细胞培养用液及培养基（液）: （1）水：双蒸水、三蒸水，可高压除菌。 （2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.2－7.4，不含钙镁离子 ，可高压除菌。 （3）消化液 ： ★ 胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为0．25 ％，pH值7.2左右。需过滤除菌。;★ EDTA液：常用浓度为 0．02％，配制时采用无Ca2+、Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。 ★ 胰蛋白酶EDTA－Na2:需过滤除菌。胰蛋白酶和EDTANa2联合使用可提高消化率，但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。 ;★ 胶原酶：适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。可用BSS或含血清的培养液配制，这样实验操作简便同时提高细胞成活率。 ;但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。胶原酶的常用剂量为 200 U／ml（约为 lmg／ml）或 0．03％～0．3％。(4)培养基（液）过滤除菌 常用0．22pm微孔滤膜。;;（8）3% L-谷氨酰胺：可作为细胞能量来源，使用量1％。但其在溶液中极不稳定，需重新加入。（9）丙酮酸钠、葡萄糖：是属碳水化合物的成分，是细胞生命的能量来源。; （10）抗生素：最终浓度为青霉素 100 U／ml，链霉素100U／ml（青霉素为80万U／瓶，将其溶解于4ml三蒸水中，每升培养液中加入0.5ml；链霉素为100万U／瓶，将其溶解在5ml三蒸水中，每升培养液加0.5ml）。 ;（11）细胞生长液：是用以维持细胞生长增殖的液体。其是配方：基础培养基 80％～90％ 血清 10％～20％ 双抗 100u/ml （12）细胞维持液：用以维持细胞缓慢生长或不死的培养液。其是配方：基础培养基 95％ 血清 2％～5％ 双抗100u/ml ;（13）冻存液：其是配方： 10％DMSO 40％小牛血清（30％FBS） 1％的5.6％NaHCO3