报道基因简介资料.ppt

报道基因SEAP 的应用;一、报告基因的概况 二、SEAP（分泌型碱性磷酸酶）; 报告基因( reporter gene)是表型易于检测并易于与内源性背景蛋白质相区别的一类基因,常作为表示转录活性的指示分子。将报道基因与表达载体的启动子序列相连, 并转染到细胞内,通过胞外信号诱导在调控序列控制下进行表达，表达产物可以在细胞内细胞膜或细胞外直接释放信号或者催化特定的酶促反应间接释放信号，再通过特定的方法灵敏并且定量检出，即检测细胞内报道蛋白的含量或活性，从而直观地报告细胞内与基因表达有关的信号级联，即报道基因技术。可在基因表达的时空调控、受体特性、药物筛选和基因导入系统等研究中可广泛应用。; 调控模型; 报告基因种类繁多，选择何种报告基因应基于不同的研究目的、实验性质所用细胞系、产物检测的时空性和检测方法，此外还要考虑报告基因的稳定性、半衰期、灵敏度和线性范围。选择报告基因还需要考虑以下方面： 1）报告基因的产物和蛋白活性的定量检测方法容易建 立，快速简便，灵敏度高，重现性好； 2）在被转染的宿主细胞中不存在报告基因产物或类似 的内源性物质； 3）报告基因表达率与目的基因转录水平同步。 报告基因技术的优点是细胞内背景活性低,而且可以将细胞表面的信号放大,产生一个高敏感、易检测的反应 。 ; 类型;从类别上，报告基因可分为 1）氯霉素乙酰基转移酶 2）β -半乳糖苷酶 3）荧光素酶 4）分泌型碱性磷酸酶 5）荧光蛋白家族 萤火虫荧光素酶、细菌荧光素酶以及荧光蛋白家族的绿荧光蛋白是目前在报告基因光学成像中最主要的3 种报告基因。;二、SEAP（分泌型碱性磷酸酶）;该酶能从表达的细胞内分泌到细胞外，对其编码产物的检测快速、简便、灵敏度高，且重现性好，因此具有作为报道基因的优良性质。;原理;SEAP的应用;2）酶联免疫法(ELISA)：; 传统细胞病变观察： 以50%细胞病变稀释度为中和血清滴度的测定方法。观 察与判定细胞病变的时间，大约在3~10天间。 基于SEAP的细胞病变检测： 以SEAP报道基因为基础的化学发光法检测5型腺病毒的 中和血清滴度时，在24小时内便可得到结果。 原因：SEAP是对侵入细胞病基因的表达产物做出的检 测，该产物在细胞生长液中的出现是伴随侵入病毒早期基因 的转录与表达而出现的。这在时间上会远远早于细胞结构因 病毒扩增而引起病变现象。;2. 基因工程抗体人源化与检测;3.定量检测;4. 基因投递检测; 双报道基因系统;1. SEAP与绿色荧光蛋白(GFP);实例： 为研究HCV的生命周期和与宿主细胞的相互作用，利用 GFP和SEAP对HCV的感染过程和细胞内的复制情况进行了 研究。设计了连接HCV、GFP和SEAP融合蛋白的基因。其 中，GFP与SEAP之间使用24个碱基和HCV丝氨酸蛋白酶底 物识别位点的基因连接。以利用病毒丝氨酸蛋白酶将两者分 离，使SEAP分泌到培养基中，得以检查。 ;2. SEAP与荧光素酶; SEAP具有的分泌性与较高的灵敏度，使得其对细胞内 表达产物的研究可进行快速的定量检测，可大大节约时间。 同时，与GFP等报道基因一起作用时，可做到定性、定位、 定量同时进行，还可实时监测表达量的变化。因此，在外源 基因实时表达量测定、细胞因子检测等方面有较大的应用前 景。