排阻色谱法资料.pptVIP

排阻色谱法;（一）定义：排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。又称为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、尺寸排阻色谱法等，是液相色谱的一种。 （二）分类： 凝胶过滤色谱法-GFC? 凝胶渗透色谱法-GPC;二、基本原理;（二）排阻色谱不适用范围 1、分子直径比最大孔隙直径大的分子全部被排阻在凝胶颗粒以外，叫做全排除，两种或两种以上的这样的分子不能达到分离效果。 2、直径比最小孔隙直径小的分子能全部进入凝胶颗粒内部，这样的两种或两种以上的分子也不能达到分离效果。; 两种排阻色谱类型比较;流动相的选择;;四、凝胶过滤介质; 由于分子内含有大量羟基而具有极性，在水和其他极性溶剂如乙二醇、二甲亚砜等中溶胀成凝胶颗粒，因醚键的不活泼性，故具有较高的稳定性。 交联度大的孔隙小，吸液膨胀也少，可用于小分子物质的分离。交联度小的孔隙大，吸液膨胀也大，适用于大分子物质的分离。 ; 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，干燥粉碎或加工成形制成粒状。适合蛋白和多糖的纯化。;（三）琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌法处理。它的优点是分子量的适用范围宽。 ;（四）亲脂性凝胶 亲脂性凝胶用于一些难溶于水或有一定程度亲脂性的样品。 1、聚苯乙烯凝胶：应用范围广，由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成。机械性能好，孔隙分布比较宽，多应用于合成高分子材料的分离和分析。 2、葡聚糖凝胶LH-20：是葡聚糖凝胶G-25分子中引入羟丙基以代替羟基的氢，成醚键结合状态，因而具备了一定的亲脂性，适用于分离黄酮、色素等有机物。 3、无机凝胶：无机凝胶分为多孔性硅胶和多孔性玻璃，机械性能好，选择性高。但其吸附性较大，处理极性大的样品需注意。;凝胶特性参数;（3）溶胀率： 某些市售的干燥凝胶颗粒（如Sephadex G系列），使用前要用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分率称为溶胀率，即 （4）凝胶粒径： 一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，分离效率越高。软凝胶粒径较大，一般为50～150?m，硬凝胶粒径较小，一般为5～50?m。;（5）床体积（bed volume） 即1g干燥凝胶溶胀后所占的体积。 （6）孔隙体积（void volume) 指层析柱中凝胶之间孔隙的体积，即V0值。孔隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。; 良好的凝胶过滤介质应满足如下要求： （1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用； （2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长； （3）具有一定的孔径分布范围； （4）机械强度高，允许较高的操作压力。 ;五、影响分离特性的因素;2、柱长 排阻色谱的分离度与柱长的平方根成正比，一般柱长60-120cm对于蛋白质的分离比较理想，而30cm的柱子多用于快速分离。 ;3、流速 流速是影响分离的重要因素。一般流速低，分离效果好。如流速在小于0.1ml/min时，蛋白质的分离度好；在 0.5-1.0ml/min时，对于7.5mm直径的柱子，分离效率较高。 4、样品容量 进样体积和样品浓度将明显影响到分离度。高浓度、小体积对分离有利。合适的蛋白质样品浓度范围一般在0.01-0.5%，样品体积是柱体积的1-3%。;六、应 用 ;（一）分子量的测定方法;样品分析 在相同条件下，得到样品色谱图，根据保留体积即可得到其对应的相对分子质量。而且峰面积（峰高）与分子数目成正比。;（二）样品溶液的处理 ①如有沉淀应过滤或离心除去; ②如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去 ③样品的粘度不可大，含蛋白为超过4％，粘度高影响分离效果。 ④上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。;凝胶色谱仪;凝胶色谱系统;参考文献;