云南省呈贡地区某蔬菜地苏云金芽孢杆菌的分离研究.doc

2013级卫生检验与检疫班实验设计  PAGE \* MERGEFORMAT 11 云南省呈贡地区某蔬果地苏云金芽孢杆菌的分离研究 201324035陈 婷 201324069邓佳佳 201324075裴婧如 201324076马 俊 201324077李竹君 201324078张蓓蓓 一、研究目的 本次实验的目的是检测土壤中是否含有苏云金芽孢杆菌，现今化学杀虫剂的长期使用给生态环境造成了严重破坏，也使害虫种群的抗药性日益提高，生物杀虫剂以其“绿色环保”的特点引起人们的广泛关注。其中，苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）制剂是目前世界上产量最大、应用最广的生物杀虫剂。它对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、螨类等许多有害昆虫有毒杀作用，而对人类、动物和农作物无害[1]。可惜的是，苏云金芽孢杆菌杀虫制剂生产成本较高，价格较贵，无法大规模使用。如果土壤中有苏云金芽孢杆菌存在，就可以避免使用各种杀虫剂，从而减少对环境、人类的??害。我们利用醋酸盐对Bt芽孢萌发的选择性抑制特性，采用选择性培养基从土壤中分离 ，并对其进行了鉴定[1]． 二、研究背景 1.发现 苏云金芽孢杆菌是一类能在代谢过程中产生芽孢和伴孢晶体的革兰氏阳性细菌，也是一类能引起昆虫致病的病原菌。自 1901年日本学者石渡繁（Ishiwata）从病死家蚕中分离出第一株苏云金芽孢杆菌以来，全世界已分离出了 71 个血清型86个亚种。其杀虫谱已由无脊椎动物节肢动物门中的鳞翅目扩大到双翅目、鞘翅目、直翅目等 9个目的昆虫；同时还发现对螨类、线形动物门中的动植物寄生线虫、原生动物门中的鞭毛虫、变形虫和草履虫以及扁形动物门中的扁虫、吸虫、绦虫等有特异毒性的菌株[2]。 2.苏云金芽孢杆菌的应用前景 自20世纪50年代Bt商品工业化以来，苏云金芽孢杆菌就以其高效安全、对人畜没有毒性、能特异杀灭目标害虫、对自然环境也不造成污染而成为全球应用最成功的生物杀虫剂之一，也是目前最研究最深入的生物杀虫剂[3]。 对于我国来说，我国是一个农业大国，农业的发展事关重大。为了更好地落实科学发展建立环保型、节约型农业，微生物农药将为农产品优质安全生产和降低有毒物质残留提供技术和物质保证[4]。 而苏云金芽孢杆菌就是一类有很好的杀虫效果，对环境不造成污染的微生物农药。 三．实验过程 （一） 样品的采集：某果园土壤的采集 在果园的整个地域随机确定至少3个位置取样；每个位置划5m*5m地面，按5点法标记5点，除去地面植被和枯枝落叶，铲除表面1cm左右的表土，去除石砾等杂质后每点采集约100~200g的土壤混匀装袋 （二）样品预处理 1、实验准备 （1）器材灭菌 （2）制备菌液 1）将所取土壤样品倒至无菌盘，用无菌摄剔除杂物，土样摊平四等分，取对角线部分混合；重复多次直至取得50~100g样品。 2）在无菌研钵中磨至均匀,称取50g加入有450ml无菌自来水的广口瓶中，充分混匀静置10分钟后取上清液置于无菌三角烧瓶中保存备用即为（1:10稀释液）。 3）用无菌吸管从上述10-1稀释液中吸取1mL 土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀得10-2稀释液，依此类推制成不同稀释度的土壤溶液，比浓度分别为10-1, 10-2, 10-3, 10-4。 4）将除菌液以外所有器材放入超净台，超净台和实验室打开紫外灯灭菌约0.5h （3）预接种 1）每个稀释度菌液取约1ml接种于至少三个烧瓶，，培养液倒入无菌三角烧瓶中，每个烧瓶约倒40ml，混匀。 2）将烧瓶置于摇床上(温度33．2℃；转数130 r/min )培养42 h后取下进行下一步实验，也可放入冰箱保存。 3）将除已接种BPA培养基以外所有器材放入超净台，超净台和实验室打开紫外灯灭菌约0.5h 4）将各稀释度的BPA培养基于75—8O℃水浴中热处理l0-15分钟备用。 （三）菌种的分离 （1）接种 取出各稀释度BPA培养基稍静置后，于每个烧瓶中吸0.5 mL加入BP平板上，涂布均匀．做好标记。注意规范无菌操作 2、 菌落计数、细菌的培养和保存 （1）培养皿倒置于30℃温箱中培养24 h，对Bt计数。（菌落形态为滴蜡状，淡黄色，不透明，边缘不规则并伴有略微突起，呈齿状[5]） （2）挑选5个类似于Bt的菌落接种到BP斜面上，在30℃温箱培养72 h 3、涂片石碳酸复红染色镜检： 原理：G﹢菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔隙缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。 （1）涂片:玻板中心滴1滴生理盐水，接种环挑取半个菌落涂布 （2）干燥固定：自然气干或酒精灯高处微微加热； （3）染色：用玻片夹夹持涂片标本，在整个涂面上滴加石碳酸复红