第二章目的基因连接及导入资料.ppt

第五节 目的基因与载体连接;二、 目的基因与载体的连接（接）; （主要有以下4种连接方式） 1) 粘性末端连接 2） 平头末端连接 3） 人工接头法 4） 同源多聚尾连接法;工具酶：基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、逆转录等相关的各种酶类。 ; DNA连接酶; 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。 ;有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。;（三） 人工接头法 合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割,产生粘性末端→连接，构建重组DNA。;用接头连接;（四）同源多聚尾连接法;尾接法;基因与载体的平末端连接方法有哪些？;（2） 同聚物加尾法 5’特意的核酸外切酶处理目的基??及质粒的平末端，移去几个末端核苷酸。运用末端核苷酰转移酶，能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3’-OH基因上,它并不需要模板链的存在,它一个一个加上核苷酸,构成由核苷酸组成的尾巴,长度可达100个核苷酸。在载体中加入dTTP和末端核苷酸转移酶，在载体3’－OH末端延伸形成单链PolyT尾巴。将两者混合发生互补连接，缺口用DNA连接酶封闭。 ;3）用化学合成的衔接物连接 DNA分子用化学合成法合成一段10－12个核苷酸，具有限制酶识别位点的寡核苷酸片段，磷酸化后，通过T4DNA连接酶，将片段分别于载体5’端和目的基因片段5’连接起来。用相应的限制性内切酶处理，产生互补的粘性末端。 4）T-A克隆法： TagDNA聚合酶在扩增目的基因DNA的同时，还能不依赖模版在产物3’末端加上两个游离的A。只要载体切口除人工加上的游离T，PCR产物即可于载体连接。;T-A克隆 T-vector两条链的5’端含有一个游离的T PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A;1.用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 2.用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。;质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？;⑵ 双向插入 经单一限制核酸内切酶（如EcoRI）切割的目的基因和载体, 因二者的粘性末端是相同的, 因此在连接反应中, 目的基因可发生双向插入, 载体对目的基因表达是有方向的, 而目的基因可双向与之相连, 这种连接若以克隆目的基因片段为目的没有影响, 若以表达为目的, 我们就要对插入的片段进行方向鉴定, 因目的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转录的, 一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就不能正确转录目的基因的mRNA。若构建表达DNA重组体选用双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组, 以便定向克隆。(YL);第六节 重组DNA导入受体细胞;?? 在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。 ; 受体细胞：也叫宿主细胞，是指在转化、转导、杂交中接受外源基因的细胞。 分为原核受体细胞(最主要是大肠杆菌)、真核受体细胞 (最主要是酵母菌)、动物细胞和昆虫细胞(其实也是真核受体细胞)。;原核生物细胞是较为理想的受体细胞： ①没有细胞壁，便于外源DNA 的进入； ②没有核膜，染色体DNA 没有固定结合的蛋白质，便于外源DNA与染色体DNA 重组； ③基因组小，遗传背景简单，便于外源基因的遗传分析； ④容易获得一致性的实验材料，培养简单，繁殖迅速，易重复。;表达真核生物基因存在一定的缺陷，很多真核生物基因往往不能在原核生物细胞内表达出具有生物活性的功能蛋白。 需要进行适当的修饰;酵母作为受体细胞，除了真核生物细胞共有的特性外，还具有以下优点： ①基因结构相对简单，其基因表达调控机制研究比较清楚，便于基因工程操作； ②培养简单，适于大规模生产，成本低廉；③可以分泌表达，便于产物的提取和加工； ④不产生毒素，是安全的受体细胞。;植物细胞作为受体细胞，除了真核细胞共有的特性外，最突出的优点就是其体细胞的全能性，一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。 不足之处是植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组DNA 分子。;动物细胞同样可以作为受体细胞。早期多采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞作为受体细胞，近年来干细