Western Bot protocol 蒲友光.docVIP

Western Blot protocol 主要试剂及缓冲液的配制1).?30%丙烯酰胺： 将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为100ml的水中。溶解，0.45um滤器抽滤除菌和杂质，置棕色瓶中保存于4度冰箱。 2).?10% SDS： 称量10g十二烷基硫酸钠，加入80ml超纯水中，加热搅拌溶解，加水至100ml室温保存备用。3).10x蛋白电泳缓冲液： 30gTris、144g甘氨酸、10gSDS、加水至1000ml 4).5x转膜缓冲液： Tris 2.424g，Glycine 11.52g，加水定容至400ml 临时配制1×转膜缓冲液(甲醇 20ml，5×transfer buffer 20ml，H2O 60ml) 5).1.5M Tris 8.8： （注意温度对tris PH值的影响） 181.5 g Tris 溶于800ml超纯水中，加浓盐酸调PH值8.8，定容至1000ml。 高温灭菌后室温保存。 6).1M Tris 6.8： 121.1g Tris 溶于800ml 超纯水，加浓盐酸调PH值6.8，定容至1000ml。 高温灭菌后室温保存。 7). 10×PBS： NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4 14.4g，KH2PO4 2.4g，用盐酸调PH至7.4，加水定容至1000ml 8). 1xPBST： 10×PBS 50ml，H2O 450ml，0.05% Tween 20 9).10%（W/V）过硫酸铵： 临时配，1g过硫酸铵溶于10ml ddH2O，4度冰箱保存3天10).?丽春红染液储存液： 0.1%（W/V）丽春红，5%（V/V）乙酸，超纯水11).?封闭液： 5%（W/V）脱脂奶粉溶于1X PBST 中，使用时现配。 操作步骤 配胶和上样电泳 1).配胶前先将玻璃板、梳子和电泳仪等洗干净，装好玻璃板用水检查是否漏水，之后并将玻璃板晾干。 2). 根据所检测蛋白的大小并参照表1选择丙烯酰胺的浓度，再根据表2配方配制分离胶。配制分离胶时要混合均匀并缓慢加入玻璃板里，注意分离胶与加样孔底间要留出1cm左右积层胶，用ddH2O封胶面。 表1 丙烯酰胺浓度（%）线性分离范围（kD) 1512-431016-687.536-94557-212 胶 浓 度 试 剂 表2 分离胶积层胶8%10%12%15%5%ddH2O2.271.931.61.11.4030% PAGE1.331.672.02.50.33Tris.HCl 1.3（1.5M tris 8.8）0.25 （1 M tris 6.8）10%SDS0.050.0210% AP0.050.02TEMED0.0050.002总体积5ml2ml 待分离胶凝后（约需15-30min，根据室内温度），倒掉ddH2O后，用滤纸条吸干水分。参照表2配制积层胶，到积层胶时尽量倒满（如果有些漏要及时补胶），插梳子前保证梳子的清洁。拔梳前，需要用刀片沿梳和玻板间隙划一次以除去玻璃板外的胶。待积层胶凝固后拔掉梳子，这时，若发现有上样孔歪斜，可以用注射器针头将上样孔调整好，之后将胶版装上电泳槽后，加上电泳缓冲液后待用，清洗时避免槽间隔异位。 3). 样品制备：将90%满度的10CM细胞平板培养基倒弃，用5ml PBS清洗一遍，加入1 ml PBS后用细胞刮将细胞刮下（可将平板对光观察， 以判断细胞刮下的完全度），移入2 ml EP管中，，4000rmp离心1分钟。（可以用1ml PBS清洗一遍。弃上清， 留少许PBS（不多于10 ul），剧烈Vortex将细胞pellet松动后，在轻微vortex的同时，逐滴加入100ul -200 ul 2xloading buffer，细胞悬液呈透明，粘状(如果样品很黏，上样时，样品会丢失，可以通过超声粉碎方法进行)。之后将EP管置于水浴锅内沸水浴10min，之后将EP管放入-20度冰箱保存。按照之前的蛋白定量结果，10cm平板大约能提取450-600ug蛋白。 4). 样品上样：取出蛋白样品融化后，12000rpm、10分钟高速离心，按照5ug/ul浓度，每孔上样30ug，至少需6ul，为保证上样量，每孔加入蛋白10ul。上样时最左边加1X loading Buffer两个道，然后依次是Marker，样品，Marker，1x loading Buffer。80V电压跑浓缩胶，100V跑分离胶。至底后停止。 2.转膜（半干转，整个操作中戴手套，不要用手触膜） ①在电泳过程中，剪好与分离胶等大的滤纸8张和PVDF膜1张（国产电泳仪分离胶大小约为8cm×6cm，BioRad电泳