瑞氏吉姆萨复合染色液.docVIP

PAGE  PAGE 3 外周血涂片的制作方法 1、采血：胶头滴管吸取血液，血液直接滴加到洗净烘干并且硅化过的载玻片的一头。 2、推片：将推片的平齐端置载玻片上血滴的稍前方，将推片略向后移使与血液相接触，血液遂于推片与载玻片的夹角间散开。以约30度的夹角向前均匀地推动推片即可制成血涂片。其薄厚度要适中，分布均匀而无空泡，边缘整齐。 ? 3、固定：推片做好后，涂片后潮干固定，以免细胞漂落太多，影响制片质量， 甲醇固定液固定：涂片直接浸入固定液内，因固定液充足，固定效果较好。但细胞易脱落而发生交叉污染，因此应该分瓶固定，固定液回收时应过滤。多数标本用此法固定，固定时间15-30分钟。 4、染色：瑞氏-基姆萨双染 1）从固定缸里取出载片后，在室温下通风晾干。将载片平放在玻璃板上准备染色。 2）所用的两种染料事先过滤好（染料中有颗粒物，会沉淀在载玻片上影响载片的质量） 3）将染料滴加到载玻片上以后，让其均匀覆盖住载片上的血细胞，染色时间约为2到3分钟。等瑞氏染液有变红的趋势时，迅速滴加与瑞氏染液等量的PBS溶液。继续染色2到3分钟。 4）染色时间到后，用PBS溶液冲片，小股水流，防止将大量的细胞从载片上冲落下来从而影响以后的观察。冲片结束后将载片放到阴凉处风干。 5）在玻璃板上放好牙签，将风干的载片倒扣在一根牙签上，从背面滴加基姆萨染液进行扣染。染色时间约为10分钟。时间到后用蒸馏水冲片，洗净染液后常温下风干。 5、封片：中性树胶封片，制作成永久涂片。 6、显微观察：将干燥后的血涂片置显微镜下观察。用低倍镜观察血涂片体、尾交界处的血细胞。在显微镜下，成熟红细胞染成粉红色；血小板染成紫色；中性粒细胞胞质染成粉红色，含紫红色颗粒；嗜酸性粒细胞含大的桔黄色颗粒；嗜碱性粒细胞胞质含有大量深紫蓝色颗粒；单核细胞胞质染成灰蓝色；淋巴细胞胞质染成淡蓝色。 所需材料：硅化过的载玻片，推片，甲醇瑞氏-基姆萨双染，过滤，PBS，牙签，蒸馏水，中性树胶，显微镜，吸耳球 1．载玻片 使用前，必须仔细清洗，并用乙醇或软布清洁。 2．推片 选择边缘光滑的载玻片，在两角分别作斜线标记，然后用玻璃切割刀裁去两角，制成约15mm宽度的推片。 目的：制备厚薄适宜，分布均匀，染色良好的血涂片 问题：细胞分布不均，染色效果差，细胞破裂等。 表1-1 涂片质量不佳及可能原因 涂片质量不佳可能原因不规则间断和尾部太长推片污染、推片速度不连续、载玻片太脏有空洞载玻片污染脂肪、油脂白细胞和血小板尾部分布不规则制片技术差涂片太长或太短推片角度不佳涂片没有尾部血滴太大涂片很短血滴太小涂片没有边缘空隙推片太宽有细胞退变现象固定延迟、固定时间太短、甲醇污染血涂片厚血滴大、血粘度高、推片角度大、推片速度快白细胞破损推片时用力过猛 瑞氏（Wright）染色法：瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料,血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质. 细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。 基姆萨（Giemsa）染色法：基姆萨染液由天青，伊红（质）组成。染色原理和结果与瑞氏染色法基本相同。但本法对细胞核（蓝）和寄生虫着色较好，结构显示更不清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。即以稀释基姆萨液代替缓冲液，按瑞氏染色法染10min。或先用瑞氏染色法染色后，再用稀释吉姆萨复染。 表1-2 染色操作注意事项及操作不当的后果 操作注意事项操作不当的后果加染液应适量过少则易蒸发沉淀，一旦染料沉积在血涂片上，则不易冲洗，使细胞深染不易检查。冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲洗染料沉着在血涂片上冲洗时间不能过久脱色冲洗完的血涂片应立放于支架上剩余水分浸泡脱色 （2）染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关。染液淡、室温低、细胞多则染色时间要长；反之，可减少染色时间。必要时可增加染液量或延长时间。冲洗前，应先在低倍镜下观察有核细胞是否染色清楚，核质是否分明。应该在具体实践中摸索合适的时间，特别是在更换染液时。每批染色液和缓冲液，均需试染，以便掌握染色时间和加缓冲液的比例。 表1-3 染色质量不佳及可能原因 染色效果可能原因纠正措施太蓝涂片太厚、冲洗时间太短、中性水pH太高、染色时间太长、稀释染液重复使用、贮存染液暴露于阳光在含1％硼酸的95％乙醇溶液冲洗2次，用中性水冲洗，待干镜检太红冲洗时间太长、中性水pH太低、贮存染液质量不佳、涂片干燥前加封片规范操作。新鲜配置中性水。保证染液质量不佳太