5.2__多聚酶链式反应扩增DNA片断分析.ppt

多聚酶链式反应扩增DNA片断;一、基础知识;脱氧 核苷酸;一个核苷酸上的磷酸基团上的“－OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3’和5’碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3’、5’磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端;脱氧核苷酸结构式;5、DNA分子的双螺旋结构;6、利用碱基互补配对规律的计算;规律三：DNA双链中，一条单链的(A+T)/(G+C)的值与另一条互补链的(A+T)/(G+C)的值是相等的，也与整个DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等;例题：甲DNA分子中，A和T占25％，G和C占75%，乙DNA分子中，G和C占25％， A和T占 75%，哪一个稳定？;2、多样性;（三）DNA的复制;5、原材料：;② RNA引物的合成;⑤ DNA片断的连接;边解旋边复制(过程）;10、精确复制的原因;①一条双链DNA分子，复制N次，形成的子代DNA分子中，含亲代DNA母链的有两个DNA分子，占子代DNA总数的2/2N；亲代DNA分子母链两条，占子代DNA中脱氧核苷酸链总数的2/2 N+1= 1/2N;（四） PCR(多聚酶链式反应）;3、 PCR原理 教材 P58;3、 PCR原理;3、 PCR原理;高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。;PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出 ;① PCR过程需要的引物是RNA或DNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸;;DNA聚合酶与DNA连接酶的异同;（五） PCR的反应过程;靶序列;②复性（退火）;靶序列;③延伸;靶序列;靶序列;3、30次循环后靶序列扩增的数量;4、PCR 循环的结果;PCR反应条件： ①稳定的缓冲液环境 ②DNA模板 ③分别与两条模板链相结合的两种引物 ④A、T、G、C四种脱氧核苷酸 ⑤耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶 ⑥能严格控制温度变化的温控设备;二、 PCR 的实验操作;PCR仪;微量移液器;1、准备;①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁;将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序;PCR三步曲;循环数;PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：;（一）理论上DNA扩增数目的计算;稀释;比色杯; PCR的突出优点;PCR的常见问题 （一）出现假阳性结果的原因： ①模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要原因。 ②样品中存在靶基因的同源序列也可能造成假阳性结果。 （二）出现假阴性结果的常见原因： ①Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制； ②提取的模板质量或数量不过关 ③ PCR系统的建立欠妥当； ④引物设计不合理； ⑤循环次数不够；等等。;五、实验小结;1.提示：绘图可参考教科书中图5-9。PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段 （2n= 230= 1 073 741 824)。 2.提示：PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验，感兴趣的学生可以参考《分子克隆实验指南》（见本专题参考书目），书中有详尽的论述。