5.01_基因工程的工具酶分析.ppt

基因工程的工具酶;;;遗传信息编码在核酸分子上，主要定位在DNA分子上。; ?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ;; ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ;基因工程的工具酶; 酶;主要内容;酶;1 限制性核酸内切酶;核酸酶（Nuclease）： 通过切割相邻两个核苷酸残基之间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。 1）按作用对象可分为: Deoxyribonuclease (DNAase) Ribonuclease (RNAase) 2）按水解断裂核酸分子不同方式可分为： Endonuclease Exonuclease;限制性内切核酸酶（restriction endonuclease): 指一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。;1.2 限制性核酸内切酶的命名;1.3 限制性核酸内切酶的分类;1.3.1 I型限制性内切酶;1.3.2 III型限制性内切酶;1.3.3 II型限制性内切酶;(1) 基本特性;限制性核酸内切酶可分为三大类: I类 能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近切割双链,但切割序列没有专一性.II类 识别位点(回文序列)严格专一,并在识别位点内将双链切断 III类 识别位点严格专一(不是回文序列),但切点不专一,往往不在识别位点内部. 因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶. ;Enzyme; 限制酶的识别位点 （1）Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列称为限制酶的识别位点（或切割位点）。 （2）它能识别dsDNA的4－6bp的回文序列并水解该部分的核苷键。一般来说是4－6bp，有6个以上的，但没有4个以下的。 （3）识别顺序呈二重对称，即1800旋转对称。如： GC CG GTNAC GAA TTC Hha CG GC MaeⅢ CANTG EcoRⅠ CTT AAG (4)酶靶顺序大小是很重要的，它决定产生特定DNA中段的大小。 若DNA碱基组成是均一的，限制酶切点是随机的，那么对于： ①?要求4bp靶序列如HpaⅡ,MboⅠ等在庞大DNA链上平均44核苷酸即可遇到一个靶序列，即1/256 ②?同理，要求6bp的酶，则平均46遇到一个靶序列，即1/4096。; 识别位点在DNA分子中的频率对于特定的限制性酶在DNA分子中的识别位点数目是可以计算的,四碱基的酶平均大约每256个核苷酸(44)有一个识别位点,而六碱基的酶大约4096(46)个核苷酸有一个识别序列,计算是在假定核苷酸随机排列的情况下进行的. 实践中这种方法不完全正确,如λ DNA长49kb,对于六碱基的酶应该有12个切割位点,实际上要少一些,如Bgl II只有6个,BamHI只有5个,而SalI只有2个.; 限制酶的切割位点： 限制性对dsDNA 2条链同时切割（其具体切割点，即磷酸二酯键断开的位点，相对二重对称轴的位置而异）产生3种不同切口： 1.形成平头末端（flush或bluntend）如 2.形成5′－粘性末端 （5′－cohesive end即3′延伸末端） 3.形成3′－粘性末端（3′－cohesive end） 粘性末端（sticky end）;; 粘性末端能与另一个相同的粘末端相连接，任何两个具有相同识别位点的DNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重组DNA分子。在进行DNA重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体DNA，使之产生相同的粘性末端，然后再将二者连接成重组DNA分子（图4.1）。;酶切产生的平端也可用连接酶连接。平端之间的连接效率比粘末端之间的连接效率要低，但因平端连接具有普遍适应性，所以极其有用。例如限制性内切酶HaeIII产生的平端，不仅能与HaeIII切出的平端或其他内切酶切出的平端连接，而且能与补平后的3