蛋白质分离技术2资料.ppt

第十节;四、层析技术;（一）层析的分类;（二）排阻层析 （凝胶层析）;1、凝胶层析的特点及应用;2、凝胶层析的原理;;3. 凝胶的种类和性质;葡聚糖凝胶(Sephadex )的物理特性;4. 层析柱的重要参数 ;⑶内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。 不包括固体支持物的体积（Vg）。 ⑷峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用Ve 表示。 当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。 当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。 ;;5. 凝胶过滤在试验室中的应用;6. 分子量的??定;（三）离子交换层析;1.离子交换层析的原理;;2. 离子交换层析的应用;3)分离纯化生物大分子物质 离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。 由于生物样品的复杂性，一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法结合使用。 使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果。;（四）吸附层析(absorption chromatography);物质之所以能在固体表面停留，这是因为固体表面的分子和固体内部分子所受的吸引力不同。在固体内部，分子之间互相作用的力是对称的，其力场互相抵消。而处于固体表明的分子所收的力是不对称的，向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影响，就会被吸引而停留下来。 吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。 吸附层析过程就是不断地产生平衡和不平衡、吸附与解吸的动态平衡过程。;实验中常用的固体吸附剂有氧化铝、硅酸镁、磷酸钙、氢氧化钙、活性钙、蔗糖、纤维素和淀粉。 常用的洗脱液有乙烷、苯乙醚、氯仿，以及乙醇、丙酮或水与有机溶剂形成的各种混合物。 吸附层析通常用于分离脂类、类固醇类、类胡罗卜素、叶绿素以及它们的前体等非极性和极性不强的有机物。 ;（五）分配层析(partition chromatography);分配系数(α)是指在一定温度和压力条件下达到平衡，物质在固定相和流动相两部分的浓度比值。 ;在层析过程中，当有机溶剂流动相流经样品点时，样品中的溶质便按其分配系数部分地转入流动相向前移动。当经过前方固定相时，流动相中的溶质就会进行分配，一部分进入固定相。通过这样不断进行的流动和再分配，溶质沿着流动方向不断前进。各种溶质由于分配系数不同，向前移动的速度也各不相同。分配系数较大的物质，由于分配在固定相多些，分配在流动相少些，溶质移动较慢；而分配系数较小的物质，流动速度较快。从而将分配系数不同的物质分离开来。;;（六）亲和层析(Affinity Chromatography) ;1. 亲和层析的原理;;;2. 亲和层析的特点;3. 亲和层析的应用;2) 激素和受体蛋白? 激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通常的层析技术分离。但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力（10-6－10–12 M）而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。;3) 凝集素和糖蛋白? 凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。 用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。 伴刀豆球蛋白A能结合含α-D-吡喃甘露糖苷或α -D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白。 麦胚凝集素可以特异的与N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神经氨酸结合，可以用于血型糖蛋白A、红细胞膜凝集素受体等的分离。 洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。;4）多核苷酸和核酸? 利用poly-U作为配体可以用于分离mRNA以及各种poly-U结合蛋白。poly-A可以用于分离RNA聚合酶以及其它poly-A结合蛋白。 以DNA作为配体可以用于分离各种DNA结合蛋白、DNA聚合