4章基因文库的建立课程.pptVIP

第四章?? ?? 基因文库的建立 ?;基因文库(gene library) 基因组文库(genomic library) cDNA文库(cDNA library) ;第一节 基因组文库的构建 ;定义： 含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。 一. 基因组文库的规模 N—基因组文库克隆总数 P—所需机率 N= f—插入片段与基因组DNA长度之比 二．建立基因组文库的一般程序 1．载体DNA片段的制备 DNA分离纯化 限制酶切 脱磷酸化反应 2． 供体DNA片段的制备 总DNA分离纯化 机械剪切法 分离特定大小DNA片段 酶法 部分酶切 分离特定大小DNA片段 完全酶切 ;用不同生物的完全基因组构建的基因组文库 应具有的克隆数和实际克隆数 ; 3. 供体与载体DNA??接 要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种DNA分子的克分子比率。 4. 重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增 利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生变化） 5. 基因组文库质量的评价 1）文库规模----随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。 2）重组频率----频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。; 三.??利用质粒载体 构建基因组文库;四.??利用λ载体构建基因组文库 1. 载体DNA片段的制备方法: 左右臂DNA片段的获得 2. 供体DNA片段的制备:限制酶部分酶切，机械剪切法 3. 重组DNA分子的形成： 控制克分子比率，使其形成串状DNA分子 4. 重组DNA分子的包装 1） λDNA的包装物的制备 使用的大肠杆菌菌株： E.coli BHB2688(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Eam Sam/λ])-包装蛋白 E.coli BHB2690(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Dam Sam/λ])-头部蛋白;; i.??? 两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合----本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。 ii.? 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单，本底高，可包装不同大小的λDNA分子。 2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用 5. 基因组文库的扩增 包装的λ颗粒 感染E.coli 培养 分离λ颗粒 -70℃保存;五.????利用COS质粒载体构建基因组文库 构建过程与λ载体构建过程相似: 两臂DNA片段的制备，供体DNA片段的制备，两DNA的连接和重组DAN分子的包装。单COS质粒载体和双COS质粒载体构建基因组文库。 为提高文库质量，可采取以下措施： 1.?双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体 2. 供体DNA脱磷酸化以避免供体DNA间的连接导致重排 3. 载体和供体DNA末端修饰以避免上述两种情形发生 载体DNA XhoI or SalI酶切 补CT 连接 重组DNA 供体DNA Sau3AI部分酶切 补AG 4. 采用文库快速构建法以避免扩增文库时DNA丢失;利用单COS质粒载体文库;利用双COS质粒载体 构建基因组文库 ;七. 利用YAC载体构建基因组文库 1. 两臂DNA片段的制备: pYAC4