1高效液相色仪探析.ppt

第五章 高效液相色谱; 第一节 概 述;达到柱效高(理论塔板数为40000-60000块／m)、分析时间短和色谱柱可连续使用的效果。;二、高效液相色谱的特点 1．高效液相色谱法与经典液相色谱法比较; 项 目; 气相色谱法只限于分析气体和沸点较低的化合物，占有机物总数的20％。;; (3) 气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。; ;类 型;。; 以强疏水性的填料作固定相，以可以和水混溶的有机溶剂做流动相的液相色谱。; 广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 ;Accela型超高效液相色谱仪-LTQ Orbitrap型高分辨液质联用仪;一、高效液相色谱仪的组成和工作流程; 流程：贮液瓶中的流动相通过泵输出，流经进样器，样品随流动相进入色谱柱进行分离后，依先后顺序进入检测器，检测器的信号经采集并进行数据处理后，得到液相色谱图及有关数据。 如果是制备，可以用馏分收集器收集样品。;1、高压输液系统;分析型高效液相色谱仪的贮槽一般有2－4个，容积为lL左右，玻璃制品。 位置：比泵大约高50cm，以保持泵前有一定的静压。;过滤：流动相在放入贮槽之前要经过0.45μm滤膜过滤，除去溶剂中的不溶物。;脱气：;（2）泵系统;名 称;单活塞往复泵; 梯度洗脱： 在同一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。溶剂的极性随时间的变化而变化。 梯度洗脱可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。;　 缩短分析周期； 提高分离能力； 峰型得到改善，很少拖尾； 增加灵敏度，但有时引起基线漂移。 ;外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 ;内梯度: 通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入一台高压泵中混合。;①要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶，超出范围后就不互溶，使用时要引起注意。当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。;?④每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。需让10~30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。;2、进样装置; 在瞬间将样品定量地注入到色谱柱的上端填料中心，形成集中的一点。; 进样阀的部件分别用不锈钢和白金陶瓷材料制成，其耐磨、密封性能好。能耐20MPa高压，可直接在高压下将样品送入柱内。 当进样阀手柄置“取样”位置时，可用特制的平头注射器注入定量的样品(5-20μL不等)，再将进样阀手柄置于“进样”位置，流动相就将样品带进色谱柱，这种进样装置的重现性好。 ;3、色谱柱 通常采用直型柱管，两端接头处设计成死体积最小，接头处均采用不锈钢或聚四氟乙烯密封圈。 标准填充柱柱管内径为4.6mm或3.9mm、长10-50cm、填料粒度5-10μm时。 一般内径小于2mm的色谱柱称为毛细管径柱；内径在2-5mm范围内的是常规高效液相色谱柱，内径大于5mm的称为半制备柱或制备柱。 ; 灵敏度高 对溶质都有快速响应 适用范围广 响应对流动相流量和温度变化都不敏感 线性范围宽。;噪声低、基线漂移小， 灵敏度高， 线性范围宽， 响应快、稳定性好。;检测器分类：; 通用型检测器适应性广泛，但灵敏度低，而且对于流动相也有响应，容易受组成、流速和温度的影响，引起较大的噪声和波动，因此不能在梯度淋洗中使用。;适用于能吸收紫外－可见光的物质。 应用最广泛，具有高选择性及灵敏度、对环境温度、冲洗剂组成及流速波动不敏感的优点，可用于梯度淋洗操作。;固定波长紫外吸收检测器; 常见的紫外-可见检测器波长在190－600nm(或700nm)，在此范围内可选定任何波长进行检测，有效光谱宽度为5nm左右。 一般选择被分析物有最大吸收的波长处进行工作，以获得最大的灵敏度和抗干扰能力。 ; 紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。;（2） 示差折光检测器 （differential refractive index detector）;（3）荧光检测