瘤胃发酵试验方法资料.docx

 PAGE \* MERGEFORMAT 16 瘤胃体外发酵方法 绞股蓝皂甙对山羊瘤胃菌群及微生物发酵特性和甲烷产量的影响_王新峰 1.2瘤胃液的采集和培养基制备 瘤胃液来自4头装有永久性瘤胃屡管的波尔山羊与本地山羊的杂交成年公山羊,日粮以羊草为主,每日补饲1509精料(精料组成,玉米:豆粕=2:1),自由饮用清洁水。于晨饲前采集瘤胃液,用4层纱布过滤,与培养基按1:2混合,在39℃培养箱中培养30分钟,并充分通入CO2,进行厌氧分装,每瓶60mL。 每升培养基中含有15.71mg CaCl2·2H2O,11.90mg MnCl2·4H2O, 1.19mg CoCl2·6H2O, 9.52mg Fe Cl3·6H2O, 0.143g MgSO4·7H2O, 76.2mgNaOH, 0.95gNH4HCO3, 8.33g NaHCO3, l.36g Na2HPO4, 1.48g KH2PO4, 2.98g Na2S·9H2O和0.298g盐酸半肌胺(Menke等,1979) 1.3试验设计 试验根据绞股蓝皂试添加量(0、5、10、20和40 mL /60mL)分为5组,对照组不加皂试,实验组分别加入5,10,20和40mg皂试。取60mL瘤胃液与培养基混合液(瘤胃液:培养基二1:2)分装于160mL的发酵瓶中,每瓶含0.69底物底物由精料和粗饲料组成(3:7),精料为玉米和豆粕,分别为0.126和0.054g,粗饲料为0.42g羊草草粉(过1mm筛)。发酵瓶封盖!气压平衡后置于39℃培养箱中培养,并定时摇匀,培养24h。第二次发酵培养120h,分别在0,1,2,4,6,8,12,24, 48,72,96,120h, 计算出累积产气量;测定120h后干物质消失率。 1.4指标测定 1.4.1产气量的测定 根据Theodorou等(1994)的方法,使用气压转换器(IGER,UK)定时测定厌氧瘤胃微生物发酵产气量。根据各产气量和气压进行校正,除去空白发酵瓶产气量,计算出累积产气量。 4.3挥发性脂肪酸的测定 取发酵液样品lmL加25%偏磷酸和巴豆酸(内标法,100mL溶液中含巴豆酸0.6464g)混合液0.2mL,-20℃冰箱保存。测定前解冻,12,000rpm离心lomin,取上清液0.6uL测定。优化胡伟莲方法测定VFA(胡伟莲,2005),柱温130℃,进样器温度为180℃,检测器温度为180℃)。高纯氮总流量30.2mL/min,柱流l.7mL/min,氢气流量40mL/min,空气流量4O0mL/min。 4.4氨态氮浓度测定 将样品与0.2N盐酸等体积混合,于-20℃保存。测定前解冻,于4℃条件下,10,000rpm离心l0min,取上清液采用比色法进行测定分析(weatherburn,1967) 4.5微生物蛋白浓度测定 取瘤胃内容物7ml保存在-20℃冰箱测定前解冻,取3ml混匀样品在1,000rpm/min,离心8分钟去除原虫和饲料残渣。取2ml上清液在25,000Xg离心20分钟(Makkar等,1982)。取10ul上清液加入到5ml考马斯亮蓝溶液中,在595nm波长下读取吸光度值,以牛血清蛋白为标准溶液计算样品微生物蛋白含量。 1.4.6原虫计数 将混匀发酵液4层纱布过滤后与9%甲醛等比例混合避光保存,用改装的血细胞计数板计数。改装后计数板的计数室高度为0.25mm,以确保较大体积原虫也能被计数(Newbold等,1987。 4.7氢的还原力 根据Demeyer(1991)挥发性脂肪酸和CH4产量计算,计算公式: 2Hr(%)=(4M+2P+2B)*100/(1A+P+4B) 其中,A,乙酸;P,丙酸;B,丁酸;M,C执(以上均为净摩尔产量)。 对瘤胃微生物发酵参数的影响 1材料与方法 1.1试验动物、日粮组成与试验设计 试验动物为4只1岁左右、体重在30士2.3kg波尔山羊与本地山羊杂交的一岁阉公羊采用4x4拉丁方设计,日粮组成为70%的羊草,20%的玉米及10%的豆粕(代谢能,2742.5kcal/kg;粗蛋白,12.96%;粗纤维,22.33%)。每期为16天,适应期H天,采样时间为5天,共4期。两次于8:00和17:00点等量瘤胃灌注。对照组以与试验组相同体积生理盐水灌注,自由饮用清洁水。 2样品采集与分析 饲料采食量分别在每期的11-13天测定。记录每日饲料添加量和剩余料量,以干物质为基础计算采食量饲喂后第14天,分别在采食前0h和采食后2,4和8h利用负压通过瘤胃痰管采集瘤胃内容物,用四层纱布过滤去除大的饲料残渣后,迅速测定瘤胃内容物的pH值,将过滤后瘤胃液分成4份。取上述过滤的瘤胃液一份,将瘤胃液与25%偏磷酸溶液按5:1比例进行混合-20℃冷冻保存,以备vFA测定(Jouany,19