一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法资料.docVIP

说明书摘要 PAGE  PAGE 1 本发明涉及一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，属于分子标记技术领域，所述的一组PCR特异性鉴别引物的核苷酸序列分别为CL-F：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’；CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法步骤为：1）提取待测样品的基因组DNA；2）以步骤1）中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进行PCR扩增；3）对步骤2）的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。本发明只需要进行PCR，然后取PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小及有无即可区分滇重楼及其混淆品，具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势。 摘要附图 PAGE 1 权利要求书 PAGE 2 1．一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：所述的一组PCR特异性鉴别引物为：CL-F：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’； CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。 根据权利要求1所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：其构建的具体步骤为： 提取滇重楼及其混淆品的基因组DNA； 以步骤1）提取的基因组DNA为模板，使用通用引物ITS2对其进行PCR扩增； 对步骤2）的PCR扩增产物进行测序； 使用BioEdit软件对步骤3）的测序结果进行序列分析，校对和对比，找出滇重楼特有的变异位点； 利用primer premier 5.0软件设计一组特异性PCR鉴别引物。 根据权利要求2所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：步骤2）中，PCR反应体系总体积为25μL，反应体系包括20mM 10×PCR Taq buffer（Mg2+plus）、10mM dNTP、上下游引物各10μM、1U DNA Taq 聚合酶、1μL DNA模板、ddH2O补足 25μL。 根据权利要求2所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：步骤2）中，PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min 35个循环。 5．一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，其特征在于：具体步骤为： 1）提取待测样品的基因组DNA； 2）以步骤1）中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进行PCR扩增； 3）对步骤2）的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。 6．根据权利要求5所述的一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，其特征在于：步骤2）中，特异性PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min 35个循环。 说明书 PAGE 7 一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法 技术领域 本发明属于分子标记技术领域，具体地说，涉及一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法。 背景技术 重楼属 (Paris L.) 是百合科多年生草本植物,《中国植物志》英文版中记载重楼属植物全世界约有39 个物种, 主要分布在欧亚大陆的热带至温带地区。该属植物在国内多做药用, 其中滇重楼(Paris polyphylla var. yunnanensis (Franch.)Hand.- Mazz.)及华重楼 [P. polyphylla var. chinensis(Franch.) Hara.] 收载于2005 年版《中国药典》, 是云南白药等多种中药的重要原料之一。 然而重楼植物分类复杂, 由于不同类群的特征性状交叉重叠，各类型界限模糊不清，给重楼药用植物鉴定带来困难。近年来，随着对重楼需求量的增大，野生重楼资源急剧减少，采集野生滇重楼不能满足市场需求,更破坏了生态环境和滇重楼资源，寻找鉴定重楼药材的有效方法迫在眉睫。有关重楼植物鉴定，已有形态学、细胞学 (包括核型和染色体多态性)和RAPD、AFLP 等DNA分子标记方面的研究，这些研究都为重楼属药用植物的鉴定提供了依据。而位点PCR技术直接利用DNA 序列进行物种的鉴定，具有独一无二的可重复性，为药用植物鉴定带来了新的机遇。 目前，运用 DNA 分子标记技术对重楼属植物进行鉴定上，有学者运用过 对滇重楼（P. polyphylla var. yunnanensis）、南重楼（Paris vi