植物基因工程操作论文.docVIP

瓜叶菊Mlo基因片段的克隆 摘 要 瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）是菊科（Compositea）多年生草本植物，是元旦、春节重要的观赏盆栽早春花卉，具有广阔的开发前景和现实意义。近年来，白粉病（Powdery Mildew）逐渐成为制约瓜叶菊商品化产业发展的重要病害之一。瓜叶菊白粉病的传统生物防治方法不仅使病原产生抗药性，还会造成成本增加和环境污染等问题。因此，利用基因工程手段培育具有广谱抗白粉病的瓜叶菊种质资源具有非常重要的意义。 Mlo基因是一种新型的抗病基因，可能参与瓜叶菊白粉病的调控过程。它与显性R基因控制的抗病基因不同，它是由单基因控制的隐性抗病基因，具有非小种专化的持久抗性，其功能类似于G蛋白偶联受体 。Mlo基因可能对细胞坏死具有负调控作用，即抑制细胞坏死，类似于其它突变体基因以寄主死亡来抵抗病原菌的入侵，Mlo基因突变为mlo基因后，对细胞死亡的负调控作用被解除，被侵染细胞可能更易死亡，由此引发广谱的抗病性。任何感病的野生型都可以通过对 Mlo基因进行诱变而获得抗性。这种抗性，即便是在粗放的栽培管理条件下，也可以在田间得到持久保存，即便没有病原菌的侵染，突变的mlo植物也表现出自身细胞壁加固（cell wall appositions，CWAs）和叶细胞的自发死亡现象。因此，对该基因的克隆以及结构和功能的研究，为瓜叶菊的抗病育种奠定了基础并提供了新思路。 本研究以瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）为试材，通过PCR方法克隆了Mlo基因片段的cDNA序列，并采用生物信息学方法对其进行预测和分析，为进一步研究瓜叶菊Mlo基因的功能和表达情况提供了理论依据。 关键词: 瓜叶菊；Mlo基因片段；PCR扩增； 1.研究的目的及意义 在温室生产的条件下，白粉病（Powdery Mildew）逐渐成为瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）栽培的主要病害，发病后严重影响瓜叶菊的生长发育和观赏性能，随着元旦、春节人们对于盆栽早春瓜叶菊需求的逐年增加，目前瓜叶菊白粉病已成为制约瓜叶菊商品化产业发展的重要病害之一。迄今为止, 化学杀菌剂的喷施是目前防控瓜叶菊白粉病的主要手段，但又往往损伤叶片和花朵，影响了观赏价值和带来环境污染[1]。在生产上，主要通过常规杂交选育的方法培育抗白粉病的瓜叶菊品种，可是由于白粉病原菌优势小种的更替及突变速度快，导致抗病选育往往落后于小种更替[2]。近年来，人们采用RNA干扰MLO(Mycoplasma-like Organism)基因技术进行白粉病的防治取得一定进展[3,4]，如果该技术应用于瓜叶菊白粉病的防治上，那么有望从根本上解决防控白粉病的问题。 瓜叶菊白粉病的Mlo基因防治机理认识还不是十分清楚，但是在大麦、番茄等作物上有研究表明，作为一种新型抗病基因，Mlo基因会使植物产生叶细胞的自发死亡现象，且在抗性调控的过程中起负调控因子的作用[5,6]。即使没有病原菌存在时，携带mlo突变基因的大麦也易引发植物本身自发性的细胞坏死，说明在细胞坏死过程中，野生Mlo基因可能起负调控作用，即抑制细胞坏死[7,8]。通过缺失或移码的方式，Mlo基因突变成为mlo后，正常功能的MLO蛋白不能被合成，因此解除了这种负调控作用，而植物的叶表皮细胞会积累具有抗真菌活性功能的酚类物质以及H2O2和O2-，其中H2O2能够直接杀死感病细胞和侵染的病原菌，从而阻碍了白粉病的入侵，并加固细胞壁，产生广谱抗病性[9,10]。 本实验以瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）为试材，采用 RT-PCR 和 RACE 方法克隆了Mlo基因cDNA全长序列，并采用生物信息学方法对其进行预测和分析，为进一步研究瓜叶菊Mlo基因的功能和获得具有广谱和持久的白粉菌抗性的瓜叶菊种质资源奠定基础。 2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 植物材料 瓜叶菊（Pericallis hybrida B. Nord.）由东北农业大学园艺实验站提供，取样液氮速冻保存于-80℃冰箱中备用。 2.1.2 实验试剂 TRIZOL购自Invitrogene公司；总RNA抽提试剂盒购自北京天根；第一链cDNA合成试剂盒，PCR扩增试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒均购于北京全式金公司，其它生化试剂均为进口或国产分析纯产品。 2.1.3 菌株及载体 大肠杆菌（E. coli）菌株Trans5α、TransT1购置于北京全式金，克隆载体pMD18 T-Vector购置于TaKaRa公司。 2.2 实验方法 2.2.1 瓜叶菊Mlo基因片段的克隆及序列预测分析 瓜叶菊RNA的提取 方法一：TRIZOL法提取RNA （1）剪取100~200mg新鲜的