第八章基因工程课程.ppt

;第一节 基因工程概述 遗传工程广义： 细胞工程、蛋白质工程、基因工程、酶工程、发酵工程 狭义：基因工程 ;→基因工程概述 基因工程是20世纪70年代初随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术。 → 1982年经美国食品及药物管理局批准，采用基因工程方法在细菌中表达生产的人的胰岛素进入市场，成为基因工程产品直接造福于人类的首例。 →1985年转基因植物获得成功。 →1996年克隆羊诞生。 →现在，人类已利用这一技术改造和创建新的生命形态、生产药品、疫苗和食品，诊断和治疗遗传疾病。 ;基因工程的基本步骤： 1. 目的基因的分离或合成。 2. 将目的基因与载体DNA连接，构建重组DNA 分子-表达载体。 3. 将重组DNA分子导入受体细胞，并获得具有 外源基因的个体。 4. 转基因生物的检测与鉴定。 5. 转基因生物的安全性评价 。;第二节 基因的分离 基因分离（克隆）包括3个步骤： 1. 目标DNA片段（基因）的分离； 2. 目标基因克隆到载体上； 3. 载体导入宿主细胞并在其中大量复制。 ;一、工具酶 1、限制性内切核酸酶 限制酶：作用于特定（异）核苷酸序列的磷 酸二脂酶。 Ⅰ型酶：仅EcoB和EcoK两种，催化限制性切 割和修饰核苷酸2种功能。 Ⅱ型酶：基因工程中应用最广泛。 Ⅲ型酶：具有特异的识别位点，识别位点是 非对称的。 ;Ⅱ型限制性酶的基本特性： ① 有特异识别和切割的序列部位； ② DNA分子上两个单链断裂的部位通常不是 直接相对的； ③ 断裂所形成的DNA片段常具有碱基互补的 单链尾巴（粘性末端）；;限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接 ; 图12-1通过用相同的限制性内切酶切割 形成一个重组DNA分子 ;限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点 ;2、DNA连接酶 DNA连接酶：重组DNA分子构建必不可少的工具酶，能催化DNA中相邻的3’–OH和5’–磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接起来。; 3、反转录酶 一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，故又称依赖于RNA的DNA聚合酶。;4、聚合酶链式反应(PCR) PCR是体外快速扩增DNA的方法,由美国的Mullis(1986)发明, 1993年诺贝尔化学奖。 PCR可对特定DNA片段进行扩增，且可用痕量DNA作模板，对DNA纯度要求也不高,可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝。;PCR反应从启动到结束称为一个循环，每个循环包括三个步骤： 1）变性：95℃，DNA 双链分离成单链。 2）退火(复性)：55℃ 左右，引物与单链的 模板DNA序列互补结合。 3）延伸：72℃左右，Taq 酶通过在引物的3’- OH端增加碱基的办法 使引物延伸。;表12-2 PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系;二、载体 载体：将外源基因送入受体细胞的工具。 载体类型：细菌质粒、噬菌体或病毒、细菌/酵母菌人工染色体BAC、YAC等。 载体特点： ① 在宿主细胞中能独立复制，即本身为复制子 ，有独立的复制起始位点。 ② 有限制酶切位点，允许外源基因插入且插入 后随载体DNA分子一同进行复制或扩增。 ③ 有选择标记，便于选择含重组DNA分子的寄主 细胞。 ④ 分子量小，多拷贝，易于操作。 ⑤ 载荷外源DNA的大小范围要宽，安全。; （1）细菌质粒：广泛应用于基因工程 ;（2）?噬菌体载体 1、?噬菌体； 2、?噬菌体DNA； 3、?噬菌体DNA中间基因簇； 4、将连接物体外包装后感染细菌，制备基因库（用于基因库构建）;（3）克隆大片段DNA的载体 黏粒载体：含有cos位点 的质粒载体，兼有λ噬菌体 的高效感染能力和质粒的易 于克隆和选择的优点。 克隆外源片段的长度在15- 45kb之间。 ;细菌人工染色体（BAC） 上述的几种载体都不能携带大于50kb的外源DNA 片段，而很多真 核生物基因长度 在50kb以上。细 菌人工染色体载 体就是为克隆更 大的外源DNA片段 而设计构建的基于 F因子的人工载体。;酵母人工染色体（YAC） YAC载体是基于酵母染色 体结构设计的，可以插入 大片段的DNA（1-2Mb）， 成为人类基因组计划 （HGP）的一种重要工具。;三、基因分离方法 一个基因就是编码一条多肽链的一个DNA片段。包括：启动子、终止子、内含子等。;1、基于文库的基因分离方法 基因文库(library)：是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因文库中分离基因的流程为： （1）构建