第三章蛋白质技术课程.pptVIP

第三章 蛋白质研究技术;第一节 蛋白质的分离与纯化;　　　　蛋白质分离纯化;一、蛋白质分离纯化的基本原则;二、蛋白质分离纯化的方法;1.离心（centrifugation）;离心（centrifugation）;①.差速离心（differential centrifugation）　　利用不同物质沉降速率的差异，通过离心速度差异分离不同质量颗粒的离心技术。 ;细胞成份的差速离心分离;②.速率区带离心（rate-zonal　centrifugation）　　也称平衡密度梯度离心，根据颗粒在介质中的沉降速度差异分离目标颗粒的方法。; ;2. 电泳（electrophoresis） ;①SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS） ②等电聚焦（isoelectric focusing ，IEF ） ③双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis） ④脉冲电泳（pulsed-field gel electrophoresis） ;①.SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）;SDS ;SDS ;②.等电聚焦（isoelectric focusing,IEF）;电泳过程中不连续电泳的三种效应： 浓缩效应， 分子筛效应 电荷效应 ;③.双向电泳（two-dimensional  gel electrophoresis）;双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis）;双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis）;④.脉冲电泳（pulsed-field gel electrophoresis）;3.层析（chromatography）;凝胶类型及型号与蛋白质分子量;层析（chromatography）; ①. 凝胶过滤层析（gel filtration  chromatography ） ;凝胶过滤层析; 基本原理 凝胶上柱后，颗粒外的外水体积（Vo），颗粒内体积称内水体积（Vi），颗粒中胶的体积（Vg），因而，总的柱床体积（Vt），Vt=Vo+Vi+Vg，Vg可忽略。Vt=Vo+Vi 。;①当kd=0时,Ve=Vo，溶质全从Vo 出来，无分配。 ②当kd=1时,Ve=Vo+Vi,溶质全进 筛子，各物质尽管有分配，但 各物质不能分开。 ③当0kd1时, Ve=Vo+kd·Vi各溶 质具不同分配，以得到分离。;②.离子交换层析（ion-exchange 　　chromatography,IEC）;离子交换层析（ion-exchange chromatography）;③.亲和层析（affinity chromatography）;;亲和层析;金属螯合层析法（MCAE）;4.膜蛋白的分离方法;几种去污剂;?低浓度时，去污剂以游离形式存在于溶液中。随着浓度的增加，它们聚合在一起，形成微团（micelles）. ?微团很小、圆球状聚集物。其亲水部分向外，疏水部分向内。 临界微团浓度（critical micelle concentration，CMC）：去污剂开始形成微团时的浓度，为去污剂的特征常数;?离子型去污剂:除了能与膜蛋白的疏水区结合外，还能结合水溶性蛋白质的疏水核心。由于它们带电，所以能够破坏蛋白质中的盐键和氢键, 使蛋白质变性。 ?非离子型去污剂:比离子型温和，不同浓度有不同作用方式 ?高浓度（CMC）时，与磷脂、膜蛋白一起形成微团. ?低浓度（CMC）时，虽然不形成微团，但仍能与大部 分膜蛋白的疏水区结合，起增溶作用.;?大部分膜周边蛋白（peripheral protein）是可溶性。它们借离子键或其他弱键与特定的膜蛋白结合，因此可用高浓度的盐或能与二价阳离子（如 Ca2+）结合的试剂进行分离。 ?开发既保持膜蛋白的天然结构，又高产和高纯度纯化方法是人们的期待。（Novagen新开发TM-PEK:　ProteoExtract膜蛋白抽提试剂盒）;第二节 蛋白质的鉴定;一、分子量测定;1.渗透压（osmotic pressure）;2. 沉降平衡（sedimentation equilibrium）;3.凝胶过滤层析（gel fitration chromatography）;4. SDS;SDS用以分析蛋白质的分子量;5. 激光解吸电离飞行时间质谱（laser desorption ionization-time of flight-mas