6第六章外源基因的表达1.pptVIP

第六章 外源基因的表达; 基因重组的主要目的 使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产的目的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。;基因工程技术的核心——基因表达技术。 基因表达——是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。 从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。;基因表达在原核生物与真核生物中的差别;基因操纵子调节系统示意图;（2）真核生物基因表达系统 转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5′和3′末端后才形成成熟的、有功能的mRNA。 mRNA只能在细胞质中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化，形成高级结构。;第三节 外源基因表达系统;基因表达系统;原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：;一、大肠杆菌基因表达系统;大肠杆菌表达系统的优越性：;大肠杆菌基因表达载体可分为3个系统：;（1）DNA复制及重组载体的选择系统;常见的复制子;② 选择标记;在基因克隆中绝大多数的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号，并且主要集中在氨苄青霉素抗性、四环素抗性、链霉素抗性、氯霉素抗性以及卡那霉素抗性等少数几种抗菌素抗性记号上。 其原因一方面是由于许多质粒本身就是带有抗菌素抗性基因的抗药性R因子；另一方面则是因为抗菌素抗性记号具有便于操作、易于选择等优点。;;大肠杆菌表达载体上一般都带有一个以上的抗生素抗性基因。表达载体上的抗药性基因赋予宿主特定的抗药性，使其能在抗生素的培养条件下正常生长。这样就可以筛除掉不含载体的宿主，同时保证载体在宿主中的稳定存在。 在构建大肠杆菌表达载体的过程中，选择何种抗生素抗性基因，还必须考虑到是否会对特定宿主细胞的代谢活动产生影响。;（2）外源目的基因的转录系统;① 启动子;启动子位于基因的上游，其序列的长度因生物的种类而异。当RNA聚合酶定位并结合到启动子序列上时，便可启动基因的转录。;外源基因在强启动子的控制下容易发生转录过头的现象，形成长短不一的mRNA混合物，而过长的转录产物不仅会影响到mRNA的翻译效率,同时也会使外源基因的转录速度大大降低，从而影响目的蛋白的翻译效率。 因此，在构建表达载体的时候一般采用强的启动子和强的终止子，以达到高效表达的目的。;②抑制物基因;通过抑制物基因产物可使目的基因在宿主培养到最佳状态时进行转录，从而保证转录的有效进行，特别是表达产物对宿主有害时，控制转录的时机尤其重要。 理想的可调控的启动子在细胞生长的初期往往不表达或低水平表达，而当细胞增殖到一定的密度后，在某种特定的诱导因子（如光、温度或化学药物等）的诱导下，RNA聚合酶才开始启动转录，合成mRNA。;③转录终止子;（3）蛋白质的翻译系统;蛋白质的翻译系统;① 核糖体结合位点;大肠杆菌SD序列的碱基组成为 5 ′AGGAGG 3 ′,其中以GGAG四个碱基最为重要，这四个碱基中的任何一个发生突变都会引起翻译效率的大幅度下降。;② 翻译起始密码子;③ 翻译终止密码子;在实际应用中，为了保证翻译的有效终止，通常将几个终止密码串连在一起。具报道，在大肠杆菌中以四个核苷酸组成的顺式序列UAAU作为终止密码，可有效地终止多肽链的合成。;不同生物基因组甚至是同种生物不同蛋白质的基因，所用的密码子都具有一定的选择性。有的密码子在一种基因组中使用的频率高，被称为主密码子，而在另一种基因组中使用的频率较低，被称为罕用密码子。 如果外源目的基因mRNA的主密码子和受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因的表达效率就高；反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达水平就低。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，要考虑所表达基因的种类和性质，或对外源基因的碱基进行适当置换，或对克隆载体上的调控序列进行适当的调整。;2、宿主菌;为了使外源基因高效表达，必须构建作为基因表达受体菌的大肠杆菌工程菌。;3、常见的大肠杆菌表达系统（了解）;（2）外源基因在大肠杆菌表达的形式;① 包涵体蛋白;包涵体的组成;包涵体形成的本质——是细胞内蛋白质的不断集聚，主要包括三个方面：;以包涵体形式表达的外源蛋白最突出的优点是： 易于分离纯化。因为包涵体的水难溶性和密度远大于其他蛋白，通过高速离心即可将包涵体蛋白与其他蛋白区分开来； 对蛋白酶表现出好的抗性。;② 融合蛋白;③ 寡聚型外源蛋白;多表达单元的重组：每个表达单元都含独立的启动子、终止子、SD序列、起始密码和终止密码，形成独立转录与串连翻译的表达单元。表达的外源蛋白不需经过裂解处理。该方式适合表达相对分子质量较大的蛋白。;④ 整合型外源蛋白;