5.4.沉淀法课程.ppt

沉淀法 Precipitation;一、沉淀法概述;生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。 任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。;沉淀和结晶的区别: 形态 成分纯度 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。 ;沉淀法操作步骤 ： ①加入沉淀剂; ②沉淀剂的陈化，促进粒子生长； ③离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。 ;沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取。 优点：设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产； 缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，产品纯度常比结晶法低，过滤也较困难。;eg. 从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达99%的免疫球蛋白和96%~99%的白蛋白。;沉淀法分离蛋白质的特点： 生产前期可使原料液体体积很快减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用； 使中间产物保持在一个中性温和的环境； 可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性； 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。;二、蛋白质的溶解特性;蛋白质性质;蛋白质胶体溶液的稳定性;蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似。 ;蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。 ;吸引力;DLVO理论;其他沉淀法;1、中性盐盐析法;中性盐盐析过程;中性盐盐析法;⑴、离子强度对盐析过程的影响;β和Ks的物理意义;; 常数Ks代表图中直线的斜率；β代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想. 溶解度的对数。从一些实验结果表明，Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。 但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过1倍。 组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。 ;⑵、用盐析法分离蛋白质的二种方法;⑵在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达到沉淀的目的，称为“β”分级盐析法。 （β盐析：固定离子强度，改变pH及温度。） 而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。;⑶、盐析用盐的选择;选用盐析用盐的几点考虑 ; 常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。硫酸铵在水中的溶解度很高但具腐蚀性，硫酸钠虽无腐蚀性但低于400C就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋白质的沉淀过程。; Hofmeister对一系列离子沉淀蛋白质的能力进行排序，称Hofmeister序列，或感胶离子序。 阴离子：柠檬酸根-3酒石酸根-3 F-I03-H2P04-S04-CH3C00-Cl-Cl03-Br-N03-Cl04-I-CNS-； 阳离子：Th4+Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+ Rb+NH4+K+Na+Li+。;图5 碳血红蛋白在不同盐溶液中的盐溶和盐析;⑷、影响盐析的因素; 左图表示对卵清蛋白和碳氧血红蛋白进行盐析时，β随pH的变化。由于β代表溶解度的对数，故β 变化一个单位，溶解度就变化 10倍。通常β在等电点附近有极小值。两种蛋白质的相对溶解度会随pH而变化很大；例如从图上可见， 当 pH从5变到6时，在一定盐浓度下，两种蛋白质溶解度之比的变化可达几千倍。 ;;2、等电点沉淀法;（1）适用于疏水性强的蛋白质； （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大； （3）无机酸通常价格便宜，无毒； （4）蛋白质对低pH 敏感，易失活。;; 许多能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓度下沉淀蛋白质。;加入溶剂后会使水溶液的介电常数降低，而使蛋白质分子间的静电引力增大，导致凝集和沉淀； 蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂所取代，从而降低了它们的溶解度。 有机溶剂可能破坏了蛋白质的某种键如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，致使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀。; 不同有机溶剂沉淀蛋白质的效率受多方面的影响，需通过试验加以选择