ExpEcoli染色体DNA提取重点.ppt

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2016-07-30 发布于湖北
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ExpEcoli染色体DNA提取重点.ppt

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;实验课设计的思路; ;一、实验目的; 通过冻融、溶菌酶或EDTA处理，并用去垢剂使细胞裂解，释放出DNA，然后用RNA酶和蛋白酶处理，使RNA和蛋白质降解，再用苯酚/氯仿抽提，离心，去除蛋白质，用乙醇沉淀DNA。;裂解液/Pro K 灭活胞内核酸酶吸附于硅基质膜漂洗-离心-洗脱;（一）材料大肠杆菌培养物（二）试剂;酚/氯仿/异戊醇(PCI)，体积比为25:24:1，采用Tris-HCl(pH8.0)饱和酚。 3mol/LNaAc (pH5.2) 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 1mmol/L EDTA (pH8.0) 20 mg/ml RNaseA酶 ;裂解液LB2 结合液BB2 清除液CB2 漂洗液WB2;（三）用具恒温摇床,培养箱, 灭菌锅,超净台,微量移液器,枪头,EP管,恒温水浴锅,台式离心机,漩涡混合器,冰箱等;常规方法 1. 收集菌体: 1ml菌液/1EP管, 12000rpm, 1?,弃上清 2. 加600?l GTE,振荡混匀 3. 加6?l溶菌酶,混匀,37℃,30? 4. 加6?l Pro K,混匀,55℃,1h 5. 加等体积PCI,混???, 12000rpm, 5? 6. 转移上清至新管,加等体积氯仿/异戊醇, 12000rpm, 5? 7. 取上清至新管,加?V 3mol/L NaAc (pH5.2),混匀,加2倍体积的无水乙醇,上下颠倒混匀,?20℃,30?, 12000rpm, 10? 8. 弃上清，取1mL70%乙醇洗涤沉淀, 12000rpm, 5? 9. 干燥后用20?l TE(含RNaseA酶)溶解,37℃,30? 10.检测DNA质量，?20℃保存;试剂盒方法;;P33思考题 3. 提取染色体DNA的基本原理是什么? 在操作中应注意什么? 4. 在使用苯酚抽提DNA时应注意什么?